1、第六部分發酵、釀造工藝實驗第一篇發酵工程設備發酵工程設備實驗項目及其各專業必修、選修表實驗序號實驗項目實驗學時實驗類型實驗類別面向專業（以下打為必修，為選修，數字為開課學期）生科生技生工食品1小型生物反應器的安裝與拆卸2驗證V (6 )V(5 )2小型連續培養實驗裝置的設計組建3綜合V (6 )V(5 )3體積溶氧傳遞系數的測定3綜合V (6 )V(5 )4搖床培養確定酵母菌體培養條件8綜合V (6 )V(5 )5反應器培養液的火菌與接種培養8綜合V(7 )6pH電極、溶氧電極的校正2驗證V(7 )7生物制品的冷凍干燥6綜合V(7 )83M 3機械攪拌通風發酵 罐結構的認識4驗證V(7 )91

2、M3中試發酵設備的操作方法12綜合V(7 )10面包酵母流加培養與分批培養試驗24綜合V(7 )實驗序號實驗項目實驗學時實驗類型實驗類別面向專業（以下打為必修，為選修，數字為開課學期）生科生技生工食品學時合計727216第二篇釀造工藝學實驗釀造工藝學實驗項目及其各專業必修、選修表實驗序號實驗項目實驗學時實驗類型實驗類別面向專業（以下打為必修，為選修，數字為開課學期）生科生技生工食品1葡萄酒釀造過程24/14綜合V (6 )，(4)2葡萄酒結束理化指標的測定8/0綜合V (6 )，(4)3葡萄酒感官品評4/2綜合V (6 )，(4)4乳酸發酵工藝10/8綜合V (6 )，(4)5醋酸發酵工藝10

3、/8綜合V (6 )，(4)學時合計56/325632第一篇發酵工程設備實驗一小型生物反應器的安裝與拆卸機械攪拌式生物反應器，又稱發酵罐，是生物工程設備的重要組成部分，在微生物工程、酶工程、細胞工程（細胞培養）、基因工程（基因工程菌）等科學研究領域，生物反應器均為生物技術轉化為產 品必要的設備。由于小型生物反應器進料、出料、清洗、電極校正等過程都不同于大型發酵罐，需要拆 卸之后進行，因此熟悉生物反應器結構及安裝與拆卸操作是正確使用反應器的前提。一、實驗目的掌握生物反應器安裝和拆卸的操作規程，認識和了解生物反應器的結構與功能。二、基本原理生物反應器裝置分兩大部分：1.罐體及內部的各傳感器、檢測電

4、極；2.罐外檢測控制裝置，蒸汽及無菌空氣系統。反應器罐體具有可卸上蓋，與罐體是通過橡皮墊圈和螺栓密封。蓋上設有接種口、空氣進口、尾氣出口、各種檢測儀表的插孔、 溫度傳感器及溶氧電極和 pH電極插口、消泡劑和酸堿液注入口、 取樣口、 備用口、壓力表、安全閥等；罐底部設有夾套層，用以熱交換，罐內有攪拌槳葉、檔板、空氣分布器；罐外：連接各種傳感器及電極相應的控制器，可以自動地調控試驗所需的培養條件；連接無菌空氣系統，并配備一臺自動調控裝置；連接蒸汽發生器，供滅菌使用。尾氣三、實驗裝置3 L園柱形機械攪拌式生物反應器圖1機械通風式攪拌生物反應器四、實驗步驟1 .首先斷開所有電源。2 .卸下可移動的所有

5、檢測電極和探頭。3 .擰下螺栓，打開上蓋，檢查培養罐內部是否清洗干凈。4 .插入校正完畢的pH電極和氧電極于罐側面相關位置，并與放大器連接。5 .加入配置好的培養液，加蓋（由于蓋上的零件較多，必須對準位置后再蓋上去），并對稱擰緊螺母,直至上蓋被密封固定。6 . 將事先清洗干凈并開啟的尾氣過濾器裝于蓋上，安裝安全閥、泡沫傳感器、觀察燈、壓力計、取樣管，以及滅過菌的無菌空氣過濾器進氣管等，剩余的孔洞須用硅膠塞和瞎塞擰緊備用。7 . 檢查檢測系統的連接，調試密閉。8 . 作出 3 L 機械通風攪拌式生物反應器的結構示意圖，注明各裝置名稱。9 . 標注檢測系統的連接。五、 思考題 1.小型生物反應器的

6、安裝和拆卸應該注意那些問題？ 2. pH 電極、 溶氧電極如何校正？實驗二 小型連續培養實驗裝置的設計組建連續培養是在培養器中不斷補充新鮮營養物質，并及時不斷地以同樣速度排出培養物，理論上對數生長期可無限延長。不同于分批培養發酵周期受培養基消耗殆盡的影響，連續培養使微生物在特定的環境中持續保持旺盛生長狀態，隨著培養基不斷加入，產物不斷生成排出，減少了非發酵時間，可提高發酵工業的生產效益和自動化水平。常用的連續培養方法有恒濁法與恒化法兩類，恒化連續培養在研究微生物利用某種底物進行代謝的規律方面被廣泛采用。 本實驗設計組建實驗室恒化法培養裝置，有助于對恒化法連續培養及裝置特性加深理解。一、實驗目的

7、 設計組建小型微生物連續發酵裝置，掌握連續發酵的操作原理和方法。二、 實驗原理恒化法是通過控制培養基中營養物主要是生長限制因子的濃度來調控微生物生長繁殖與代謝速度的連續培養方式。由于培養基質加入流量與產物流出的流量保持恒定，隨著培養時間的推移，培養器中各物質濃度不隨時間改變， 稱為恒化法， 設計恒化器培養裝置除滿足液體深層培養所必須的條件外，著重在于滿足上述條件。三、實驗儀器與材料 三角瓶、玻璃槽、玻璃管、棉花、蠕動泵、橡膠管、磁力攪拌器、溫度計、酒精噴燈四、實驗步驟1. 用實驗室儀器設計一套恒化法連續培養裝置（厭氧培養），并組建安裝。2. 畫出你所組建的簡單連續培養裝置示意圖并注明各裝置的作

8、用。3. 設計出求算單級連續培養比生長速率的實驗步驟及求算科的過程。五、 思考題1.在你組建的裝置中如何實現培養器中基質濃度的恒定？如何保證培養過程無污染？2.連續發酵培養在工業生產與科研上的意義？實驗三體積溶氧傳遞系數的測定單位體積發酵液氧傳遞系數kLa可稱為 通氣效率”，不同類型的發酵罐由于供氧裝置的不同其體積溶氧傳遞系數不同，kLa大意味著反應器供給單位發酵液的氧的能力強。通過kLa的測定，可了解發酵過程中氧的傳遞效果的好壞，對提高氧的利用率和增產節能都有著重要意義。一、實驗目的學習運用亞硫酸鹽法測定小型生物反應器的 kLa值。二、基本原理 用Cu2+為催化劑，溶解在水中的氧能立即將水中

9、的SO32室化成為SO42-,其氧化反應的速度在很大范圍內與 SO32-的濃度幾乎無關。因此氧化速率是控制氧化反應的因素。其反應式如下：2Na2SO3+ O22Na2SO4剩余的Na2SO3與過量的碘作用Na2SO3+l2+H2O1K Na2SO4+2HI剩余的I2用標定的Na2s2O3溶液滴定。標準Na2s2。3溶液的用量取決于溶解氧的量。每1 ml溶氧可氧化2 mol Na 2SO3,也就消耗掉4 mol Na 2s2O3。因此每消耗1 mol Na 2s2O3 (與對比 樣的體積差)必有 1/4 mol溶氧在通氧過程中參與反應。則：溶氧當量 NV V N 60 mol/(L h) m t

10、 4Nv=K La C c*-c)KLa= Nv/0.21三、實驗儀器與材料3 L生物反應器、250 ml三角瓶、25 ml移液管、滴定臺、滴定管、Na2SO3、CuSO4、碘溶液、Na2s2O3四、實驗方法與步驟1 .稱取12.6 g Na2SO3和0.072 g CuSO4。按實驗一方法打開發酵罐，將 1 L自來水加入到發酵罐中，開 始攪拌，依次加入 Na2SO3晶體和CuSO4,攪拌使完全溶解。取樣 10 ml,作為未通氣的對照組，注入 預先準備好的過量的碘溶液中。2 .安裝好發酵罐，檢查使密閉。開閥通氣，打開攪拌器到常用轉速。氣閥開啟迅速調至預定空氣流量。當罐內溶液中有氣泡冒出時，開始

11、計時，作為通氧時間的開始。3 .氧化時間持續10-20 min,到預定時間停止通氣和攪拌，準確記錄通氧時間。4 .取木¥ 10 ml作為樣液，注入預先準備好的過量的與對照組所注入的相同量的碘溶液中。5 .在對照組與樣液中分別加入淀粉溶液3滴作為指示劑，分別用標定的Na2s2O3溶液滴定，至碘溶液中藍色消失。6 .分別記錄對照組與樣液滴定所消耗Na2s2O3溶液的量。五、實驗結果滴定前讀數滴定后讀數滴定消耗量 V對照液滴定V1=樣液滴定V2=六、思考題 1.kLa的大小受哪些因素的影響？2.測定kLa值其他方法有哪些?實驗四搖床培養確定酵母菌體培養條件正交試驗（Orthogonal e

12、xperimental）是研究多因素多水平的試驗方法，它是根據正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了均勻分散，齊整可比”的特點，是一種高效率、快速、經濟的實驗設計方法，可大幅度減少試驗工作量，因而正交試驗在很多領域的研究中已經得到廣泛應用。本實驗即是利用正交試驗的方法選擇酵母最佳培養基以掌握正交試驗的方法。一、實驗目的通過搖瓶法確定發酵周期，學習應用正交法確定發酵培養基最佳配比。二、實驗原理1.培養周期的確定。生物量的測定方法有比濁法和直接稱重法等。由于酵母在液體深層通氣發酵過程中是以均一混濁液的狀態存在的，可采用直接比濁法進行測定。搖瓶培養中通過定期取樣測定

13、酵母濃度，找出對數生長末期確定為培養終點。2.最佳培養基的確定。在碳源、氮源、無機鹽初步確定的前提下，通過四因素三水平正交試驗，可判斷四因素組合時各因素的最佳濃度，從而確定最佳培關苴 釬舉。三、實驗儀器與材料1.實驗儀器：全恒溫振蕩培養箱，分光光度計、電熱恒溫水浴槽、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、天平；250 ml三角瓶、50 ml三角瓶、移液管（移液槍）。2.試驗材料：葡萄糖、蔗糖、 酵母膏、KH 2 P。4。四、實驗方法與步驟1.養基的配制（見表1, 2）表1正父表試驗設計(100 ml)因素水平葡萄糖蔗糖酵母膏KH 2PO411.00.00.50.522.01.01.01.033.02.02.

14、02.0表2正交表實驗方案編R葡萄糖蔗糖酵母膏KH 2 PO4生物量 （OD）(A)(C)0h 12h24h 36h48h60h(B)(D)1(1)(1)(1)(1)2(1)(2)(2)(2)3(1)(3)(3)(3)4(2)(1)(2)(3)5(2)(2)(3)(1)6(2)(3)(1)(2)7(3)(1)(3)(2)8(3)(2)(1)(3)9(3)(3)(2)(1)KiK2K3極差R2. 取250ml三角瓶將上述培養基配制200 ml,取6個50 ml三角瓶各裝入培養基10 ml,及剩余的培養基（用于測定時稀釋，當 OD 值小于或大于）于121 下滅菌 30 min ，冷卻。 （制備無菌

15、水）3. 冷卻后接種 0.5 ml （接種量為 5） ，置于 28 培養箱進行培養。4. 測 OD 值：將接種 0 h、12 h、 24 h、 36 h、 48 h、 60 h 不同時間的菌懸液搖均勻后于560 nm 波長、1 cm 比色皿中測定OD 值。比色測定時，用以未接種的培養基作空白對照，并將OD 值填入表中，最終確定最佳培養基的組成及發酵時間。5. 作各因素水平的K 圖。6. 根據試驗數據判定發酵時間及最佳培養基配比。五、思考題 1. 為什么要作 K 圖？如果實驗繼續深入，應該改變那些因素水平，為什么？ 2.R 值反應的是什么？有何意義？實驗五 反應器培養液的滅菌與接種培養小型臺式玻

16、璃生物反應器置于高壓鍋中滅菌， 而金屬制生物反應器的滅菌是采用夾套層蒸汽加熱滅菌的方式進行的。 由于結構的差異小型生物反應器滅菌與大型發酵罐滅菌操作有一定的差別， 小型生物反應器的上蓋上有眾多的電極接口， 需防止蒸汽打濕； 蒸汽的進出口路線也有所不同， 需保證蒸汽進出暢通。通過實際操作熟悉滅菌的過程。1、 實驗目的 學習和掌握生物反應器滅菌與接種培養的操作， 認識和掌握運用現代化反應器的操作規程及方法。2、 實驗原理將反應器內培養液的溫度升至121 ， 以達到滅菌的效果， 滅菌后的培養基冷卻至培養溫度后，即可接種培養。接種時，嚴格按照無菌操作進行，避免雜菌污染。三、實驗儀器與材料1.實驗儀器5

17、L 升生物反應器、蒸汽發生器、反應器控制臺、三角瓶； 2.實驗材料 菌種：酵母菌；培養基：葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，無機鹽。四、實驗步驟與方法1 .滅菌：在反應器安裝就序后，接通電源，打開控制臺總開關，開啟冷卻水閥，分別按下溫度、pH 、溶解氧、 攪拌器開關鍵， 調節攪拌器轉速約 120 rpm ， 調整滅菌時間 （ 30 min） ， 設置滅菌溫度（121 ） ，同時，按下滅菌開關鍵。使電加熱器對罐底夾套層進行加熱，罐內溫度逐漸上升， 待溫度升至105 左右時，關閉廢氣出口閥。溫度繼續上升至滅菌溫度，自動保溫至設定時間后，由冷卻水自動冷卻至設置的發酵溫度。2 . 培養條件的確定：通人反應器的空

18、氣是從空壓機經空氣過濾器而成無菌空氣，再由空氣分布管送入滅過菌的培養罐內。在控制臺上，設定所需的攪拌轉速、發酵溫度、 pH 值，并將空氣流量計的流量調至確定值。3 .接種與培養：將事先培養好的培養液（在三角瓶中進行搖床培養，處于對數生長期的細胞，以無菌操作方式倒入已滅過菌的帶有插在保險管套筒內的注射針及軟管的三角瓶內） 由接種口接入罐內， 接種時，要在接種口的隔膜周圍放上浸有酒精的棉花或用 1-3 ml 乙醇覆蓋，點燃，以產生上升的氣流來防止雜菌污染。接種塞從無菌筒內取出，然后將接種針穿過火焰和隔膜，慢慢插入中心部位，擰緊連接螺帽，直至插入部分固定。接種量大體上是培養液的百分之幾。如調節 pH

19、 值和泡沫時，可將酸液和堿液及消泡劑裝入三角瓶，滅菌后，分別經蠕動泵與反應器連接，與罐體連接的方法與接種相同。這樣，通過控制臺的自動控制，就可以自動地連接流加，使罐內保持所需pH 值和泡層狀態。4 . 取樣：為了了解培養過程中反應物的變化情況，必須定時地進行取樣，取樣時，要關閉排氣口，使罐內處于正壓狀態，打開取樣口，培養液即可自動流出。但是，在第二次取樣時，必須注意將殘液放凈 后再取樣。五、思考題 1. 本實驗是采用何種方式滅菌的？你所了解的反應器滅菌方式有哪幾種？2. 如何保證接種過程中不使反應器內部發生雜菌污染？實驗六pH 電極、溶氧電極的校正為了準確測定發酵液的 pH 值和 0D 值，每

20、發酵周期需對pH 電極和溶氧電極進行校正。特別是a)長期未用的電極和新換的電極；b)被測溶液溫度與標定時溫度相差過大時尤需校正。pH 電極的校正一、實驗目的 了解 pH 電極、溶氧電極的基本原理，掌握其校正方法及步驟。二、實驗原理待校正的 pH 電極是由氯化銀參比電極和玻璃電極組合在一起的復合玻璃電極。復合電極的內層玻璃管與玻璃球泡相通，內充以恒定 pH 植的標準緩沖溶液，從中引出氯化銀電極導線，組成玻璃電極(即指示電極) 。在外層玻璃管引入銀絲，其表面覆蓋一層AgCl 薄膜。從上部擴大部分邊上的注液口加入飽和氯化鉀溶液， 就形成氯化銀電極， 在外玻璃管的下部， 開有一小口， 裝有多孔陶瓷芯，

21、使 KCl 溶液可稍許向外溶液滲漏， 即所謂液絡部。 復合電極的基本性能參數有電極轉換系數 (也稱 Nernst 斜率) ，電極零電位，電極內阻，參比電阻，電極響應時間，耐高溫沖擊的次數等等，它們都有一定的要求和測試方法， 對新使用的電極或已經發酵運行一段時間的電極， 其性能參數要發生變化， 對某些性能參數要進行測定，決定是否可投入使用。三、實驗儀器與材料復合玻璃電極、pH操縱器、標準pH試劑、蒸儲水、Na2HPO4、檸檬酸四、實驗方法與步驟打開 pH 操縱器、測量范圍和溫度開關，將pH 電極的電插頭插入放大器插孔。首先測標準pH 試劑的溫度，然后記下緩沖液瓶子標簽上的溫度條件下所得到 pH

22、值。緩沖液和電極組件應該是在同樣的溫度，如果不是，則允許23 分鐘時間達到熱平衡。溫度恒定后，調節溫度。將電極浸入緩沖液 pH7.0 (0.2 mol/LNa 2HPO4 16.47mL, 0.1 mol/L檸檬酸3.53 mL)中，獲得穩定 讀數就立即將pH 表(asymmetry )設定到緩沖液的值。將蒸餾水漂洗電極玻璃球泡部位，然后用軟紙輕輕擦干，再浸入第二種緩沖液pH9.2 ( 1/15mol/LNa 2HPO4)或 pH 4.0 (0.2 mol/LNa 2HPO4 7.71mL, 0.1 mol/L 檸檬酸 12.29 mL)中，獲得穩定讀數 后，用斜率電位計( mV/pH )糾正

23、 pH 值。如此反復2-3 次，直至讀數與被測試劑相同并穩定。以上程序不得顛倒，否則不能獲得有效的校準。圖2復合玻璃電極的構造五、思考題 1.在pH電極的校正操作過程中應注意哪些事項？溶氧電極的校正一、實驗目的了解溶解溶氧（DO）電極的基本原理，掌握其校正方法。二、實驗原理a電解型電極b原電池型電極圖3氧電極的類型1 .（極譜型）電解型電極電解型電極是由一個陰極（貴重金屬如鉗或金）、一個陽極（Ag/AgCl ）和一種電解質，如中性NaCl溶液組成的。在某一溶氧濃度一定的溶液系統中，通過電極之間約0.6-0.8的電壓，使溶解氧在陰極上被還原，從電極的電流 電壓極譜圖（圖6）可以看出，OA為極譜殘

24、余電流；A點為氧的分解電壓，當 外加電壓大于分解電壓A,這時電極輸出電流I隨著電壓增大而增加，當達 B點后，電極電流就不再隨著外加電壓而增加，即電極電壓進入恒LN*)«41-3 d4 心防 0 8I*J5(V)10 u so圖4擴散電流與氧濃度的關系定區，這時稱為飽和電流或擴散電流。當外加電壓繼續增至C點時，電極輸出電流迅速增加，這是由于水被還原成氧所造成的。從圖中也可看出飽和電流與溶氧濃度成正比關系。因此，只要把外加電壓固定在電流電壓圖中的平坦部分，電極輸出電流就可以校正測量溶解氧，這個固定電壓常選在0.60.8 V之間。反應式為：陰極：O2 + 2H2O +2e- - H2O2

25、+ 2OH-H2O2 +2e- - 2OH-陽極： Ag +Cl- AgCi + e-總反應：4Ag + O2 + 2H2O + 4Cl- 4AgCl + 4OH -用NaCl或KCl作為電解質，電解質在使用過程中被消耗，必須在一段時間后補充。2 .原電池型電極原電池型電極不采用外電壓，而是選用參比電位比陰極電位高的堿性金屬（鋅、鋁或鎘）作陽極， 以貴重金屬（銀或金）作陰極，這是氧就在陰極自發地被還原，產生電動勢。銀一鉛電池型電極的電子反應為：陰極：O2 +2H2O + 4e- - 4OH-陽極：Pb - Pb+ 2e-總反應：O2 +2Pb + 2H 2O - 2Pb（OH）2隨著時間的推移

26、，這一反應也會氧化電極。為了校正氧電極，使液體被空氣中的氧飽和，假定飽和度被擴大至100%顯示。電極的零點適宜用氧氣調節，因為電極顯示是氧分壓而不是氧濃度，顯然在 1 M KCl溶液中飽和時氧的實際濃度只有其 在水中濃度的73%,但還是假定空氣飽和時，在 1 M KCl溶液中得到與在水中相等的數值顯示。三、實驗儀器與材料溶氧電極、DO測量放大器（指示組件）、壓縮空氣、水浴鍋、鐵架臺、Na2SO3。四、實驗方法與步驟1. 將氧電極置于與恒溫水浴（溫度調至與被測發酵液相等）相連接的內部盛有水的帶夾套燒杯中，并置于氣體分布管的上方，電極的連線與放大器連接并將放大器開關打開。2. 設置 0 ：將電極置

27、于飽和Na2SO3 溶液中，待DO 測量放大器顯示電壓值穩定，調節零電位器，使數字顯示器達到 0 值。3. 設置滿量程：將空氣通入氣體分布管，使帶夾套燒杯中的水被空氣飽和，使其達到充分攪拌。設置壓力選擇器至三檔中的任何一檔（即 100， 200， 800 mmHg ） ，使數字顯示器指向約95% ，再操作斜度電位器，仔細調節指示值，至95%顯示。4.精度檢查：用惰性氣體N2通入氣體分布管，使水飽和。顯示器將指向0,而在此操作期間，壓力選擇器 0 和斜度電位器不再調節。五、思考題 1.在校正溶氧電極時為何要待DO 測量放大器顯示電壓值穩定？ 2.溶氧電極如何保養？實驗七、生物制品的冷凍干燥冷凍干

28、燥是利用升華的原理進行干燥的一種技術， 將被干燥的物質在低溫下快速凍結， 然后在適當的真空環境下使凍結的水分子直接升華成為水蒸氣逸出的過程。 在眾多的干燥方法中最能保證熱不穩定性生物制品的質量： 即生物活性不變、 外觀色澤均勻、 形態飽滿、 結構牢固、 溶解速度快， 殘余水分低。應用于疫苗、抗生素、菌種保藏等。要獲得高質量的生物制品（包括部分發酵制品） ，對凍干的理論和工藝應有一個比較全面的了解。一、 實驗目的 學習和掌握冷凍干燥設備的工作原理、 應用范圍和操作要點； 掌握應用凍干法干燥生物 活性物質的方法和要求。二、實驗原理 物質在干燥前始終處于低溫（凍結狀態），同時冰晶均勻分布于物質中，升

29、華過程不會因脫水而發生濃縮現象，避免了由水蒸氣產生泡沫、 氧化等副作用。 干燥物質呈干海綿多孔狀，體積基本不變，極易溶于水而恢復原狀。在最大程度上防止干燥物質的理化和生物學方面的變性。三、實驗儀器與材料ALPHA1-2 凍干機、超低溫冰箱、生物酶制劑、圓底燒瓶。四、實驗方法與步驟1. 預冷凍。將已測酶活性的酶溶液置于冷凍容器中，于-80 超低溫冰箱2 h 進行預凍。2. 啟動冷凍干燥機，當溫度下降至-54 以下時，打開冷凍機蓋快速放入需要凍干的材料（注意戴手套操作，并打開瓶塞） ，密封凍干器。3. 抽真空，使真空度達到 20 Pa,維持36 h左右。4. 待凍干材料呈粉狀或膜狀后，關閉真空泵及

30、凍干機，待真空撤去后，先封好瓶蓋，再取出凍干材料。5. 將已凍干的酶測定活性，比較凍干前活性。五、注意事項1 . 制備樣品應盡可能擴大其表面積，厚度不超過 1 cm ，其中不得含有酸堿物質和揮發性有機溶劑；2 . 樣品必須完全凍結成冰，如有殘留液體會造成氣化噴射；3 .注意冷阱約為-65 C,可以做低溫冰箱使用，但必須戴保溫手套操作防止凍傷；4 .啟動真空泵以前，檢查出水閥是否擰緊，充氣閥是否關閉，有機玻璃罩與橡膠圈的接觸面是否清潔 無污物，良好密封；5 . 一般情況下，該機不彳#連續使用超過48小時；6 .樣品在冷凍過程中，溫度逐漸降低，可以將樣品取出回暖一段時間后（仍處于冰凍狀態），繼續干

31、燥, 以縮短干燥時間。六、思考題 1.采用凍干法制備生物發酵劑中應注意哪些問題？實驗八 3M3機械攪拌通風發酵罐結構的認識機械攪拌通風發酵罐在制藥、生物制品的生產開發中起著特別重要的作用。在眾多類型的發酵設備中，兼具通氣又帶機械攪拌的標準式發酵罐用途最為普遍，廣泛使用于抗生素、氨基酸、有機酸、酶制 劑等領域，在生物制品工廠廣泛使用。據不完全統計，占發酵罐總數的70%-80%,故又稱通用式發酵罐。一、實驗目的通過實地觀察，了解機械攪拌式發酵罐的內部結構組成，各裝置的配備安裝及功能。二、實驗原理 機械攪拌式發酵罐主體包括罐身、攪拌器、軸封、消泡器、中間軸承，空氣分布器、擋 板、冷卻裝置、人孔等，配

32、套裝置：各工藝參數監測系統、空氣除菌系統、蒸汽熱力系統等。發酵罐主 體各裝置依據設計規范達到各自設置的作用。三、實驗設備3M 3機械攪拌通風發酵罐.四、實驗方法與步驟1 .打開人孔及內視燈觀察以下各裝置。1.1 罐體的材料、高徑比、封頭形式。1.2 攪拌器組數、葉輪類型。1.3 擋板的組數及安裝。1.4 空氣分布裝置的形式。1.5 軸封的類型和結構。1.6 消泡裝置類型和安裝。1.7 冷卻裝置的類型。1.8 進料、進氣、排料、出料、取樣裝置。1.9 加熱、冷卻裝置。1.10 壓力、溫度、pH、溶氧控制接口。2 .作出3 M3機械通風攪拌式生物反應器的結構示意圖，標注以上各裝置名稱。圖5機械攪拌

33、通風發酵罐參考示意圖3 .考察本設備配備的蒸汽系統組成。4 .考察本設備所配備的空氣除菌系統組成，并作出空氣除菌流程示意圖。五、思考題 1.小型和大型生物反應器設計上有什么不同點？2.本設備所選用的攪拌葉輪、機械消泡裝置、冷卻裝置分別為何種形？除此之外分別還有哪些類型？3.本設備配備的蒸汽系統蒸汽生產量多大？5 .本設備所配備的空氣除菌系統為幾級？分別采用何種過濾器？實驗九1 M3中試發酵設備的操作方法發酵車間實地訓練是培養技能型人才，增強工程意識的必要途徑。通過中試發酵設備全方位的直接操作真正提高學生的適應能力和實戰技能。一、實驗目的 1.通過發酵中試車間實訓， 體驗上罐操作的全過程。2.熟

34、悉車間管路布置及各設備性能。3.掌握空氣過濾系統操作、冷卻系統操作、工藝參數控制。4.加深對分批培養的基本原理及過程的理解。二、實驗原理微生物技術產品從實驗室到工業生產的開發過程中，需要進行小試、中試、生產逐級放大培養，中試培養已經近似于生產發酵。其工藝環節包括：空消、實消、空氣除菌、接種、移鐘、消泡、進料、取樣、出料等；工藝參數控制包括：溫度、 pH值、溶氧、壓力等。、實驗設備與材料1M3機械攪拌通風發酵罐、食用菌。相忖1莖圖6發酵罐檢測裝置配備示意圖四、實驗操作步驟1 .空消：首先，清洗培養罐內部，特別要注意在空氣分布或取樣管導出殘留污物。罐內加入20%30%的水后，通入加熱蒸汽（蒸汽需經

35、過濾膜過濾），在121c下殺菌15 min。殺菌過程中不斷地打開閥門， 確保徹底殺菌。殺菌完成后，從取樣管將罐內液體排出。2 .培養基制備：培養基的加入量一般為罐容積的50%60%。將稱量好的培養基組分，經溶解后加入到發酵罐中。此時培養液的體積為實際所需培養基容積的80%。由于蒸汽殺菌過程中有大量的蒸汽轉變為水，使發酵液體積增大。對于合成培養基的滅菌操作，葡萄糖與磷酸鹽應分別滅菌后，在開始培養前加入以避免在殺菌過程中，葡萄糖與氮化合物之間發生美拉德反應，以及磷酸鹽與其他金屬離子形成沉淀。3 .安裝控制裝置：安裝調試好 PH電極、溶氧電極。4 .實消與冷卻：夾套內通入加熱蒸汽，是培養液溫度達到8

36、0 c以上。隨后將蒸汽直接通入發酵罐，在121c下殺菌15 min。殺菌過程中，間斷打開各閥門，排出內部空氣，以保證各出管內殺菌完全。此時 如果不采用夾套預熱至一定溫度，直接通入蒸汽殺菌的話，培養基裝置內冷凝水增加，將增加培養液體積調節的難度。殺菌完全后，夾套內通入冷卻水，進行培養基的冷卻。為保證罐內正壓，應通入適量無菌空氣。5 .操作條件的設定：在無菌條件下連接好酸、堿消泡劑等流入管線。設定好通風量（一般為0.52L/min.L ）、溫度和 pH 值。6 .接種、培養：將浸有酒精的脫脂棉圍繞在接種口周圍，點火后打開接種口，加入無菌水，調節好罐 內培養液量（必要時應加入葡萄糖、 磷酸鹽等溶液）

37、，進而將種子培養液注入。 接種量一般為1%10%, 蓋好接種口后，調節攪拌轉數至所需值，培養開始。7 . 取樣：為了解培養過程中的變化，需定時取樣進行樣品分析。由于罐內為正壓，打開取樣管時，樣品自然流出。 取樣時應將上一次取樣時殘留在取樣管中的培養液去除后在取樣。 另外， 取樣后應通入加熱蒸汽，以防取樣管路污染雜菌。8 . 培養結束：將電極與培養液全部取出，培養液在121 下殺菌 15 min 后，排出到指定地點。罐內應沖洗干凈。五思考題 1.發酵罐的放大有哪些方法？國內常用的方法有哪些？實驗十 面包酵母流加培養與分批培養試驗流加培養又稱補料分批培養，是在分批培養的過程中，間歇或連續地補加新鮮

38、培養基的培養方法。其優點可使發酵系統中維持很低的限制性底物濃度， 減少底物的抑制或其分解代謝物的阻遏作用， 避免出現限制性底物濃度過高影響菌體得率和代謝產物生成速率的現象。 本實驗通過面包酵母流加培養與分批培養的結果加以驗證。一、實驗目的 1. 以斜面菌種活化為起始，經實驗室菌種擴大、車間菌種擴大至發酵罐培養，熟悉發酵培養的全過程； 2. 對比分批培養與流加培養面包酵母菌生長過程及菌體得率； 3. 鞏固滅菌、空氣過濾、冷卻、發酵罐工藝參數控制等操作過程； 4. 加深補料分批續培養的基本原理的理解，熟悉流加補料過程的控制方法； 5. 熟悉菌體離心分離及真空干燥過程的操作。二、實驗原理面包酵母在通

39、風供氧充足的前提下，培養基中葡萄糖為限制性基質，葡萄糖的濃度對于提高酵母得率是至關重要的。 本實驗面包酵母培養的目的是獲得最大酵母濃度， 因此采用葡萄糖流加培養，并比較同樣條件下分批培養的效果。三、菌種與培養基1. 菌種：面包酵母2.培養基酵母斜面培養基10。麥芽汁固體斜面，pH5.0;酵母搖瓶種子培養基10。麥芽汁，pH5.0或葡萄糖 10% ，玉米漿 1% ，尿素 O.2% ， pH5.0 ；酵母分批發酵培養基玉米粉經液化、糖化，折合葡萄糖濃度為 10% ，玉米漿 1%，硫酸銨 0.4% ， pH5.5 。四、實驗設備與材料1.30L 、 300L 種子罐； 3M3 全自動發酵罐；2 .搖

40、床；3 .超凈工作臺；4 .離心機；5 .顯微鏡；6 .分光光度計7 .滅菌鍋8 .培養箱9 .真空干燥箱10 .試管，棉塞，500ml三角瓶，5L三角瓶，分口膜。五、實驗方法與步驟1 .分批培養1.1 總流程斜面培養（斜面培養基配制、滅菌，接種，培養） 一搖瓶種子培養一種子罐培養（糖化液稀釋 至10%濃度，添加輔料，滅菌，接種。）一發酵罐培養 一菌體分離。1.2 斜面種子制備自保藏斜面中挑取一環酵母菌體接入新鮮的斜面試管中，于28c培養箱中培養24h。1.3 搖瓶種子的制備將上述培養好的斜面種子接入500ml三角瓶裝的滅過菌的100ml搖瓶種子培養基中，在28 C, 200rpm震蕩培養15

41、-20h。1.4 種子罐培養于30L發酵罐裝入20L發酵培養基，121c滅菌20min,冷卻至30C,將培養好的搖瓶種子接入發酵罐（接種量2-3%）進行發酵。培養條件為：溫度28C,攪拌轉速200rpm,通風量1vvm。1.5 發酵罐培養 按實驗八中步驟，進行空罐滅菌（包括空氣過濾器滅菌）、實罐滅菌操作。消泡劑滅菌。將種子罐中的酵母菌種壓送至發酵罐，通氣量在3- 5 L/min ,攪拌轉數200rpm ,接種量10%。發酵條件1.4同種子罐培養。1.6 過程監控0小時：取樣測定總糖和還原糖；4-24小時：每隔4小時取樣鏡檢、測定還原糖、菌體濃度。2 .流加培養2.1 種子制備同分批培養種子制備

42、過程。2.2 流加培養前的準備工作葡萄糖于流加儲罐滅菌。2.3 流加培養通氣量3-5 L/min,攪拌轉數 200 rpm ,接種量10%。控制流加儲罐壓力使達到流加25g/100mL葡萄糖，當發酵罐內葡萄糖濃度達到2030g/L,滴加0.1 mol/L氨液，控制培養液pH值為1.1 。通過調節風量和攪拌轉數控制溶氧濃度在10%左右。1.4 過程監控 同1.6步驟。3 .菌體離心分離將分批培養與流加培養發酵液用布袋初步過濾，放入離心機，轉速1000r/min ,10min.。4 .菌體干燥4.1 將離心分離后的菌體置于不銹鋼托盤放入真空干燥箱，將箱門關上，并關閉放氣閥，開啟真空閥， 再開啟真空

43、泵電源開始抽氣，使箱內達到所需真空度，關閉真空閥，再關閉真空泵電源開關。4.2 把真空干燥箱電源開關撥至“處，設定溫度 60C,箱內溫度開始上升，當箱內溫度接近設定溫度時，加熱指示燈突亮突熄，反復多次，一般 120min以內擱板層面進入恒溫狀態。4.3 當所需工作溫度較底時，可采用二次設定方式，如所需工作溫度60 C,第一次可以設定 50 C,等溫度過沖開始回落后， 再第二次設定60 C,這樣可降低甚至杜絕溫度過沖現象， 盡快進入恒溫狀態。（注 意：智能型儀表請參照操作方法）4.4 干燥時間12h.當干燥時間較長，真空度下降，需再次抽氣恢復真空度，應先開啟真空泵電機開關， 再開啟真空閥。4.5

44、 干燥結束后，先關閉電源，旋動放氣閥，解除箱內真空狀態，再打開箱門取出物品。（解除真空后，因密封圈與箱門吸緊變形不易立即打開箱門，經過一段時間后，等密封圈恢復原形后，才能方便開啟箱門。）5 .稱重 干燥結束后取出菌體，計算菌體總得率。六、分析方法1 .菌體量（X）生物量的測定生物量的測定方法有比濁法和直接稱重法等。比濁法。以空白培養基為對照，在550 nm處測定發酵液的吸光值。酵母濃度測定（濕重法）:吸取5ml菌液，2500rpm離心5min ,去上清液，稱量菌體濕重。2 .還原糖的測定斐林試劑法3 .發酵活力的測定（選彳）:稱取0.26g鮮酵母，力口 5g在30c下恒穩1h的面粉制成面團。置

45、于30c水中.測定面團從水底浮出的時間。浮起時間在15min內認為樣品合格。4 .分析決定初始體積 V0,比生長速率 科及菌體濃度X的測量，補料速度F與補料濃度SF的計算與控 制。七、實驗結果 1.分別畫出分批培養與流加培養過程中，培養液中葡萄糖（g/L）、酵母菌體量（g/L）隨流加培養時間的變化曲線；2.分別計算酵母產率（質量分數，葡萄糖）。八、討論 1.流加培養與分批培養菌體濃度的區別何在及原理分析；2.推導理想狀況下準穩態恒速流加與與時間參數的方程。第二篇釀造工藝學實驗實驗一葡萄酒的釀造一、目的與要求1 .確定葡萄酒釀造的最佳工藝條件，同時簡單了解葡萄酒釀制的工藝原理。2 .掌握干紅葡萄

46、酒釀造中發酵的監控方法及相關的操作要求。3 . 了解如何確定葡萄酒酒精發酵的結束，同時對葡萄酒進行分離和封裝，轉入后發酵階段。4、熟悉各個理化指標的測定方法。二、實驗原理葡萄酒釀造就是將葡萄轉化為葡萄酒。它包括兩個階段：第一階段為物理化學或物理學階段，即在釀造紅葡萄酒時，葡萄漿果中的固體成分通過浸漬進入葡萄汁，在釀造白葡萄酒時， 通過壓榨獲得葡萄汁；第二階段為生物學階段，即酒精發酵和蘋果-酸乳酸發酵階段。葡萄酒釀造的目標就是，實現對葡萄酒感官平衡及其風格至關重要的這些口感物質和芳香物質之間的平衡，然后保證發酵的正常進行。醛母菌C.Hq » £CtH5OH+2 C Os蕭萄糖

47、酒精+二氧化碳葡萄的糖分，全部由葡萄糖與果糖構成，這兩種糖在酵母作用下， 直接發酵生成乙醇和二氧化碳及種種副產物，同時放出熱量。二、實驗儀器與材料1. pH計、手持糖量計、溫度計、天平、量筒、燒杯、比重計、水浴鍋、電爐、移液管、錐形瓶、容量 瓶、5L玻璃瓶、塑料盆，紗布。2.斐林試劑A、B液，1%次甲基蘭，0.1mol/L氫氧化鈉溶液、1%酚酬:指示劑、鄰苯二甲酸氫鉀，95%酒精，鹽酸、亞硫酸、白砂糖、酵母、 KHCO 3O三、實驗方法與步驟（一）原料篩選：選擇新鮮、無腐爛、充分成熟的葡萄釀造葡萄酒。選好原料后注意除去殘枝敗葉和青 果，盡量避免接觸水分和長期存放。無論生產白葡萄酒還是紅葡萄酒，

48、都要選用含糖量高的原料，含糖多則產酒精多，如果100毫升的葡萄汁中能夠含17克糖，也就是17%的含糖量， 發酵后酒精度可以達到10度。此外， 含酸量最好是0.6-1.0克/毫升葡萄汁， 以造成酸性環境，便于酵母菌的生長繁殖，同時也可以增進葡萄酒的風味。葡萄的出汁率越高越好，這樣可以少用原料，降低成本。要達到以上要求， 葡萄就要充分成熟。我國栽培的優良釀酒葡萄品種很多，例如， 釀造白葡萄酒的品種有意斯林、霞多麗、雷司令、賽美容、白詩南、白玉霓、瓊瑤漿、龍眼等。釀造紅葡萄酒的品種有赤霞珠、品 麗珠、梅鹿輒、寶石、西拉、黑彼諾、法國蘭、蛇龍珠等。（二）破碎：破碎的目的是使葡萄汁液與酵母菌接觸，這樣，

49、酵母菌可以充分地利用葡萄汁中的糖分進行發酵。破碎時要注意以下幾點：1、破碎要充分，盡量使每顆葡萄果粒的果皮都能被壓破。2、破碎時不要壓破種子，以免種子中的油脂、 單寧、糖昔等物質溢流到葡萄汁中而引起葡萄酒產生麻、澀、苦等異味。3、避免與銅、鐵容器接觸，以免增加酒中的銅、鐵含量，影響酒的質量，破碎機和壓榨機與葡萄汁接觸的部件最好用不銹鋼制成。4、腐爛的果粒和沒有成熟的青果粒都會影響酒的質量，破碎前應摘除干凈。5、作紅葡萄酒，破碎時要將果梗去除，因為果梗中含有較多的單寧、樹脂等，會給酒帶來過重的澀味。而且，果梗中的水分較多，帶梗破碎會增加葡萄汁的含水量、降低含糖量。破碎是用各種類型的破碎機進行的。

50、（三）壓榨：壓榨是將果實的汁液或剛完成發酵的新酒與果實皮、渣分離開的工序。作紅葡萄酒時，壓榨是在前發酵完成以后進行的， 而作白葡萄酒時， 壓榨是在發酵以前進行的。為提高出汁率，作白葡萄酒時可以帶梗進行破碎和壓榨， 另一方面， 因為作白葡萄酒是果汁發酵， 果汁中單寧含量少， 如 果帶梗壓榨可以增加葡萄汁中單寧含量， 反而對酒的澄清有利。 壓榨的關鍵是掌握好壓力， 既要使葡萄汁或者新酒被充分地壓榨出來， 又不能壓破種子。 為了保證酒的質量， 可以采用分次取汁的方法， 將不加壓力或者稍加壓力便自行流出的汁稱為自流汁， 是作優質酒的原料， 大約占汁液總量的 50%-55% ，然后施加壓力榨出的汁稱為壓

51、榨汁， 亦可用來釀制質量較好的酒。 如果在果實皮渣中加人水， 攪拌后還可溶出一些可溶性的物質， 然后再榨出的汁稱為 “ 二道汁 ” ， 這種汁液只能作質量較差的酒， 或 者發酵后進行蒸餾作白蘭地。（四）果汁成分的調整 ：果汁中的糖、酸和單寧等，既與發酵有密切的關系，又影響成品品質。釀制一般果酒， 壓榨的果汁即可進行發酵， 但為了使釀成的酒中成分接近， 且質量良好， 并促使發酵安全進行，必須根據果汁成分的情況進行調整。1. 糖分調整 ：糖是產生酒精的基礎。酒精的含量對于葡萄酒的貯藏是有力的保證， 酒精含量低的新酒在陳釀期間很容易受到雜菌的感染， 一般來說， 酒精度為 14度以上的酒才是安全的。所

52、謂“ 酒精度 ”是指在100毫升的酒液中含有1毫升的酒精為酒精度 1度。 而生成1度酒則需要在100毫升葡萄汁中含有1.7克的糖或者 1 升葡萄汁中含有17克糖。 增加酒精濃度的方法有兩種， 一是補加糖使生成足量濃度的酒精，一是發酵后補加同品種高濃度的蒸餾酒或經處理過的酒精。 實踐中， 釀制優質葡萄酒須用前者。 補加酒精量以不超過原果汁發酵的酒精量的 10%為宜。生產上， 可以根據我們所要求達到的酒精度以及葡萄中實際的含糖量來計算需要加人的糖量。（舉例來講， 現有含糖量為 14%的葡萄， 要釀造 1000升14度的葡萄酒， 需加多少糖？已知， 100升葡萄汁需1.7公斤糖生成1度酒。那么， 1

53、00升葡萄汁需1.7*14 公斤糖生成14度的酒， 即為 23.8公斤糖。100升葡萄汁中現有糖14公斤。需加糖23.8-14=9.8公斤。）加糖時還應結合酵母菌對糖液濃度的適應性。酵母菌在含糖20克/100毫升以下的糖液中，繁殖、發酵都較旺盛，再增高糖濃度，繁殖、發酵就延緩。因此，生產上釀制高酒度的葡萄酒常用分次加糖法，即先加適量的糖，以適應酵母旺盛地繁殖發酵，等發酵降低糖濃度后， 再加剩余的糖。 加糖時先將糖溶于一部分葡萄汁中， 然后再兌到全部葡萄汁中去， 并將其攪拌均勻2. 酸度調整 ：發酵時，果汁中的含酸量以0.6 1.2克/100毫升為適宜。這是因為酵母菌只有在適宜的酸性條件下才能正

54、常的生長和繁殖。此外， 有機酸有利于色素的溶解， 改進果酒的色澤， 還可以增進果酒的清涼口感。 若酸度低于0.5克/100毫升，則另加酒石酸或檸檬酸或酸度高的果汁調整。 酸過高， 除了用糖漿降低或用酸低的果汁調整外，還可用中性酒石酸鉀中和。（五）裝瓶（入罐） ：葡萄裝量不超過瓶容的80，以預留足夠空間便于發酵期間二氧化碳氣和熱量的排放，防止氣體聚集引起的溢罐或者爆瓶；同時按汁量加入 6080mg/LS02,攪勻，S02添加量的計算：葡萄果實X70%X60/0.06 1000 o并加入果膠酶20mg/L（或按說明書）同時取汁測糖、酸、比重、溫度。（六）酵母的活化添加 ：采用工業專用酵母，按照 200mg/L 的量稱取酵母，