1、大腸桿菌基因工程201220131271 韓武 生物技術一班 大腸桿菌的基因工程一 大腸桿菌表達的優缺點二 大腸桿菌工程菌的構建策略三 大腸桿菌工程菌構建，分析，篩選四 大腸桿菌生產實用重組蛋白基因工程步驟010203060504菌種貯存與保護目的基因的表達與篩選受體細胞的增值目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因獲取 目的基因的獲取目的基因的獲取 方法1 從基因組文庫獲取2 pcr技術擴增目的基因3 通過dna合成儀用化學方法合成表達載體的構建 外源基因在大腸桿菌中高效表達原理啟動子終止子核糖體結合位點密碼子質粒拷貝數將目的基因導入受體細胞 對于大腸桿菌微生物來講可以

2、用ca+2處理大腸桿菌，再將目的基因的載體轉移到大腸桿菌中。啟動子最佳距離的探測 EEAEE啟動子A 酶切開Bal31酶解目的基因目的基因啟動子啟動子 啟動子的篩選啟動子的篩選AprorigalKpKO1終止密碼子采用鳥槍法戰略，將合適大小的采用鳥槍法戰略，將合適大小的DNADNA片段克隆到啟動子探針片段克隆到啟動子探針pkopko上。上。受體細胞染色體受體細胞染色體DNADNA上的上的galEgalE、galTgalT與質粒上報告基因與質粒上報告基因galk的表達產物聯的表達產物聯作用作用。可將培養基中的半乳糖酵解成可將培養基中的半乳糖酵解成紅色素物質紅色素物質轉化轉化galEgalE+ +

3、、galTgalT+ +、galKgalK- -的大腸桿的大腸桿菌受體菌株菌受體菌株含有外源啟動子活性的含有外源啟動子活性的重組克隆重組克隆1啟動子啟動子構建-35區序列-10 區序列啟動子Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac啟動子構建啟動子構建終止子終止子選擇與使用 目前外源目前外源基因表達質粒中常用的終止子是來自大腸桿菌基因表達質粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱操縱子上的子上的rrnT1T2以及以及T7噬菌體噬菌體DNA上的上的Tf f。對于一些終止作用較弱的終。對于一些終止作用較弱的終止子，通常可以采用二聚體終止子串聯的特殊結構，以增強其轉錄終止止子，通常可以采用二聚

4、體終止子串聯的特殊結構，以增強其轉錄終止作用作用 終止子也可以象啟動子那樣，通過特殊的探針質粒從細菌或噬菌體終止子也可以象啟動子那樣，通過特殊的探針質粒從細菌或噬菌體基因組基因組DNA中克隆篩選中克隆篩選核糖體結合位點外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻率，外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。大腸桿菌細的翻譯起始效率密切相關。大腸桿菌細胞中結構不同的胞中結構不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數百倍。時可高達數百倍

5、。mRNA翻譯的起始效率主要由其翻譯的起始效率主要由其5 端的結構序列端的結構序列所決定，稱為所決定，稱為核糖體結合位點核糖體結合位點（RBS） 核糖體結合位點大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個特征結構要素：大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個特征結構要素：位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列5 UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3端區域3 AUUCCUCC 5并與之專一性結合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，但有些基因也使用GUG

6、或UUG作為翻譯起始密碼子；SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成；基因編碼區5 端若干密碼子的堿基序列 密碼子不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質編碼基因，對簡并密碼子使用頻率不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是生物基因組中的堿基含量生物基因組中的堿基含量 在富含在富含AT的生物（如單鏈的生物（如單鏈DNA噬菌體噬菌體f fX174X174）基因組中，）基因組中，密碼子第三位上的密碼子第三位上的U和和A出現的頻率較高；而在出現的頻率較高；而在GC豐富的生如鏈霉菌）基因組中，豐富

7、的生如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有第三位上含有G或或C的簡并密碼子占的簡并密碼子占90%以上的絕對優勢以上的絕對優勢密碼子與反密碼子相互作用的自由能密碼子與反密碼子相互作用的自由能細胞細胞內內tRNA的含量的含量按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規律，設計更換外源基因中不適宜的相應簡并密按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規律，設計更換外源基因中不適宜的相應簡并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長激素在大腸桿菌中的高效表達均采用了碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長激素在大腸桿菌中的高效表達均采用了這種方法這種方法質粒拷貝數 將質粒導入大腸桿菌中，在大腸桿菌生長達到對數期時，質粒會大量拷貝增殖，進而對大腸桿菌生

8、長以及目的基因表達產生阻礙。故應將重組質粒控制在可控范圍內。大腸桿菌基因工程菌構建 包涵體型異源蛋白的表達 分泌型異源蛋白的表達 融合型異源蛋白的表達 寡聚型異源蛋白的表達 整合型異源蛋白的表達 蛋白酶抗性或缺陷型表達系統的構建大腸桿菌工程菌構建 這些構建大腸桿菌工程菌的方法，都是利用大腸桿菌本身特性，來達到目的基因高效、穩定、快速表達。目的基因導入受體細胞 對于微生物大腸桿菌，可以用ca+2處理，使其達到感受態，感受態細胞可以吸收周圍DNA,進而可將含有目的基因的載體吸附。目的基因的檢測與測定 這樣得到的大腸桿菌會有四種 一 沒有轉入質粒的大腸桿菌 二轉入質粒，但質粒上沒有外來基因（轉化子）

9、 三轉入進質粒，質粒上有基因但沒有目的基因（重組子） 四轉入質粒，質粒上有目的基因(目的重組子）表達與篩選對于標定的目的基因的大腸桿菌進行培養擴增，誘導表達，進而采用多種方法鑒定篩選一 營養缺陷型篩選二 抗藥性篩選三 顯色篩選 對于微生物常用藍白斑法鑒定大腸桿菌 挑選出轉入目的基因的大腸桿菌進行培養，送到相應部門進行DNA擴增，獲取更多基因。也可以對大腸桿菌進行低溫保存處理。大腸桿菌基因工程實例 胰島素的合成 早期人類從動物體內直接提取，生產效率低。 化學合成 用化學方法合成，成本高 基因工程 以大腸桿菌為受體生產胰島素 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建A鏈和B鏈同時表達法tacb-Galo

10、riAprMetMetMMNCB peptideA peptide化學合成AB鏈編碼序列重組人胰島素轉化分離純化CNBr 處理特異性裂解體外折疊重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建生產技術的評價： 由于A鏈和B鏈上共存在六個半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對率較低，通常只有10% - 20%，因此采用這條工藝路線生產的重組人胰島素每克成本高達100美元以上。 為了進一步降低生產成本，美國Ely LiLi公司隨后又建立了第二條生產重組人胰島素的工藝路線。A鏈B鏈同時表達法重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建（人胰島素原表達法）基因工程菌的構建戰略：tacb-GalC peptideoriAprMetMetMMNCB peptideA peptide人胰島素原的cDNA重組人胰島素原轉化分離純化重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建人胰島素原表達法生產技術的評價： 在人胰島素原表達工藝中，由于C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構象，三對二硫鍵的正確配對率也相應提高，折疊率高達80%以上。雖然這條工藝路線并不比AB鏈分別表達