1、DNA 的復制的復制 DNA通過復制將遺傳信息由親代傳遞給通過復制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過轉錄和翻譯，將遺傳信息傳子代；通過轉錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質分子，從而決定生物的表現遞給蛋白質分子，從而決定生物的表現型。型。DNA的復制、轉錄和翻譯過程就構的復制、轉錄和翻譯過程就構成了成了遺傳學的中心法則遺傳學的中心法則。 RNA病毒的遺傳信息貯存在病毒的遺傳信息貯存在RNA分子分子，遺傳信息的流向是遺傳信息的流向是RNA通過復制，將遺通過復制，將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過反轉錄傳信息由親代傳遞給子代；通過反轉錄將遺傳信息傳遞給將遺傳信息傳遞給DNA，再由，再由DNA通過通過轉錄和

2、翻譯傳遞給蛋白質，這種遺傳信轉錄和翻譯傳遞給蛋白質，這種遺傳信息的流向就豐富了息的流向就豐富了中心法則的內容中心法則的內容。 中心法則中心法則Crick于于1954年所提出的遺傳信息傳遞規律年所提出的遺傳信息傳遞規律1954年首次年首次提出的提出的“中心法則中心法則” 1970-1980年年的的“中心法則中心法則” 21世紀后修正世紀后修正的的“中心法則中心法則” 一一. DNA復制概況復制概況 DNA在復制時，以親代在復制時，以親代DNA的每一條單鏈的每一條單鏈DNA作模板，作模板，合成完全相同的兩個雙鏈子合成完全相同的兩個雙鏈子代代DNA，每個子代，每個子代DNA中都中都含有一條親代含有一

3、條親代DNA.這種現象這種現象稱 為稱 為 D N A 的 半 保 留 復 制的 半 保 留 復 制 ( s e m i - c o n s e r v a t i v e replication)。 DNA以半保留方式進行復制，是在以半保留方式進行復制，是在1958年年由由M. Meselson 和和 F. Stahl 所完成的實驗所完成的實驗所證明。所證明。2、實驗證據（1958 Meselson 和Stahl ）： Matthew Messelson Franklin Stahl復制叉與復制子 DNA的復制是由固定的起始點開始的。一般把生物體的復制單位稱為復制子(replicon)。 一

4、個復制子只含一個復制起點。復制時，雙鏈DNA要解開成兩股鏈分別進行，所以，復制起點呈叉子形式，被稱為復制叉(Replication fork)。復制叉（復制叉（Replication forkReplication fork）：）： DNADNA復制時在復制時在DNADNA鏈上通過解旋、解鏈和鏈上通過解旋、解鏈和SSBSSB蛋白的結合等蛋白的結合等過程形成的過程形成的Y Y字型結構稱為字型結構稱為復制叉復制叉. .復制叉復制叉復制叉復制叉部分生物復制子的比較從復制原點到終點，組成一個能夠獨立進行復制的從復制原點到終點，組成一個能夠獨立進行復制的DNADNA復復制單位叫復制子制單位叫復制子復制子

5、復制子 ：原核生物只有一個復制原點，整個染原核生物只有一個復制原點，整個染色體只有一個復制單位。色體只有一個復制單位。真核生物有多個復制起始點，真核生物有多個復制起始點，因此是多復制子。因此是多復制子。每個復制子在每一次細胞循環中只啟動一次。每個復制子在每一次細胞循環中只啟動一次。 DNA復制是從復制是從DNA分子的特定位置開始的，這一位分子的特定位置開始的，這一位置叫復制原點（復制起始點）（大腸桿菌用置叫復制原點（復制起始點）（大腸桿菌用ori表示，表示，酵母酵母ARS）。是由一些具有特定核苷酸排列順序的）。是由一些具有特定核苷酸排列順序的片段組成。富含片段組成。富含A-T。 在原核生物中，

6、復制起始點通常為一個，而在真核在原核生物中，復制起始點通常為一個，而在真核生物中則為多個。生物中則為多個。 復制起點復制起點DNA復制時，以復制起始點為中心，向兩個方向進行復制。但在低等生物中，也可進行單向復制（如滾環復制）。 雙向復制雙向復制 真核生物基因組可以同時在多個復制起點上進行復制，也就是說它們的基因組包含有多個復制子。 細菌、病毒和線粒體的DNA分子都是作為單個復制子完成復制的；原核生物DNA的復制雙向復制( Bidirectional Replication ) 無論是原核生物還是真核生物，DNA的復制主要是主要是從固定的起始點以雙向等速復制方式進行的。 復制叉以DNA分子上某一

7、特定順序為起點，向兩個方向等速生長前進。DNA Synthesis 由于DNA雙螺旋的兩條鏈是反向平行的，因此在復制叉附近解開的DNA鏈一條是53方向，另一條是35方向，兩個模板極性不同。 所有已知DNA聚合酶的合成方向都是53， 為了解釋DNA的等速復制現象，日本學者岡崎（Okazaki）等提出了DNA的半不連續復制模型（semi-discontinuous replication）。半不連續復制Semi-discontinuous replication岡崎片段前導鏈的連續復制和滯后鏈的不連續復制在生物界是有普遍性的，因而稱之為DNA的半不連續復制。3H Thymidinepulse-ch

8、ase labeling and alkaline sucrose gradient: discovery of semi-discontinousreplication用3H脫氧胸苷短時間標記后提取DNA，得到不少平均長度為2-3kb DNA片段。用DNA連接酶溫度敏感突變株進行實驗，在連接酶不起作用的溫度下，有大量小片段累積，說明復制過程中至少有一條鏈首先合成較短的片段，然后再生成大分子DNA。由于由于DNA聚合酶只能以聚合酶只能以53方向聚合方向聚合子代子代DNA鏈鏈，即，即模板模板DNA鏈鏈的方向必須的方向必須為為35。因此，分別以兩條親代。因此，分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代

9、鏈作為模板聚合子代DNA鏈時的方式是鏈時的方式是不同的。不同的。DNA的半不連續復制的半不連續復制 以以35方向的親代方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈作模板的子代鏈在復制時基本上是連續進行的，其子代鏈在復制時基本上是連續進行的，其子代鏈的聚合方向為鏈的聚合方向為53，這一條鏈被稱為，這一條鏈被稱為前導鏈前導鏈(leading strand)。 以以53方向的親代方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈為模板的子代鏈在復制時則是不連續的，其鏈的聚合方鏈在復制時則是不連續的，其鏈的聚合方向也是向也是53，這條鏈被稱為，這條鏈被稱為滯后鏈滯后鏈(lagging strand)。 由于親代由于親代DNA雙鏈在

10、復制時是逐步解開雙鏈在復制時是逐步解開的，因此，滯后鏈的合成也是一段一段的，因此，滯后鏈的合成也是一段一段的。的。DNA在復制時，由滯后鏈所形成的在復制時，由滯后鏈所形成的一 些 子 代一 些 子 代 D N A 短 鏈 稱 為短 鏈 稱 為 岡 崎 片 段岡 崎 片 段(Okazaki fragment)。 岡崎片段的大小，在原核生物中約為岡崎片段的大小，在原核生物中約為10002000個核苷酸，而在真核生物中個核苷酸，而在真核生物中約為約為100個核苷酸。個核苷酸。 二二. 參與參與DNA復制的酶復制的酶雙螺旋雙螺旋DNA復制是復制是DNA聚合酶催化的酶促反聚合酶催化的酶促反應過程。應過程

11、。DNA聚合酶只能延長已有的聚合酶只能延長已有的DNA或或RNA引物鏈，不能從頭起始引物鏈，不能從頭起始DNA鏈的合成鏈的合成；在復制叉結構區內，在復制叉結構區內，DNA雙螺旋中的兩條鏈雙螺旋中的兩條鏈纏繞在一起，要拷貝每一條鏈都必須將纏繞在一起，要拷貝每一條鏈都必須將雙螺雙螺旋旋DNA解旋并釋放或吸收由此產生的扭力解旋并釋放或吸收由此產生的扭力，這就要求雙螺旋和超螺旋的解旋與重新形成，這就要求雙螺旋和超螺旋的解旋與重新形成，DNA聚合酶不能完成這一過程聚合酶不能完成這一過程;在不連續合成中形成在不連續合成中形成短的岡崎片段的連接也短的岡崎片段的連接也是是DNA聚合酶無法完成聚合酶無法完成的。

12、的。 DNADNA旋轉酶旋轉酶( (拓撲異構酶）拓撲異構酶）； 使使DNADNA雙股鏈在復制叉解開的雙股鏈在復制叉解開的解旋酶解旋酶； 在在DNADNA復制前防止解開的復制前防止解開的DNADNA單鏈局部退火單鏈局部退火的的DNADNA結合蛋白結合蛋白； 合成合成RNARNA引物的酶引物的酶； 除去除去RNARNA引物的酶；引物的酶； 使岡崎片段共價連接的使岡崎片段共價連接的DNADNA連接酶連接酶1、DNA聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶種類和生理功能：種類和生理功能： 在原核生物中，已發現的在原核生物中，已發現的DNADNA聚合酶有五種，聚合酶有五種，分別命名為分別命名為DNADNA聚合酶

13、聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚 合 酶聚 合 酶 （ p o l p o l ） ，） ， D N AD N A 聚 合 酶聚 合 酶 （polpol），）， DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol）。）。 前三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能前三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。參與酶。參與DNADNA復制的主要是復制的主要是polpol和和polpol。 參與參與DNA復制的復制的DNA聚合酶，必須以一段具聚合酶，必須以一段具有有3端自由羥基端自由羥基（3-OH）的）的RNA作為引物作為引物(primer) ，才能開始聚合

14、子代，才能開始聚合子代DNA鏈。鏈。1. RNA引物的大小，通常為引物的大小，通常為110個核苷酸。個核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基的堿基順序相配對。順序相配對。 RNA引物引物 pol為單一肽鏈的大分子蛋白質為單一肽鏈的大分子蛋白質,可被特可被特異的蛋白酶水解為兩個片段，其中的大異的蛋白酶水解為兩個片段，其中的大片段稱為片段稱為Klenow fragment，具有，具有53DNA聚合酶聚合酶活性和活性和35外切酶外切酶的的活性。活性。 Contains two catalytic sites, one for addition of dNTPs a

15、nd one for removal of the mispaired dNTP. binds to two metal ions that alter the chemical environment around the catalytic site and lead to the catalysis. (2) Monitors the accuracy of base-pairing for the most recently added nucleotides by forming extensive hydrogen bond contacts with minor groove o

16、f the newly synthesized DNA. Exonuclease site/proof reading site Binds to the incoming dNTP, encloses the correct paired dNTP to the position for catalysis Bends the template to expose the only nucleotide at the template that ready for forming base pair with the incoming nucleotide Stabilization of

17、the pyrophosphate Not directly involved in catalysis Interacts with the synthesized DNA to maintain correct position of the primer and the active site, and to maintain a strong association between DNA Pol and its substrate. pol 由十種亞基組成，其中由十種亞基組成，其中亞基具有亞基具有53 DNA聚合酶活性，因而具有聚合酶活性，因而具有復制復制DNA的功能；而的功能；而亞

18、基具有亞基具有35外切酶外切酶的活性，因而與的活性，因而與DNA復制的復制的校正校正功能有功能有關。關。 DNA聚合酶和是在1999年才被發現的，它涉及DNA的錯誤傾向修復(errorprone repair)。 當DNA受到較嚴重損傷時，即可誘導產生這兩個酶，使修復缺乏準確性（accuracy)，因而出現高突變率。高突變率雖會殺死許多細胞，但至少可以克服復制障礙，使少數突變的細胞得以存活。 原核生物中的三種原核生物中的三種DNA聚合酶聚合酶 pol pol pol pol pol pol 5 533聚合酶活性聚合酶活性 + + + + + + 5 533外切酶活性外切酶活性 + + - -

19、- - 3 355外切酶活性外切酶活性 + + + + + + 生理功能生理功能 去除引物去除引物, ,填補缺口填補缺口 未知未知 DNA DNA 復制復制 修復損傷修復損傷 校正錯誤校正錯誤 校正錯誤校正錯誤 在真核生物中，目前發現的在真核生物中，目前發現的DNA聚合酶聚合酶有五種，分別命名為有五種，分別命名為DNA聚合酶聚合酶（pol ），），DNA聚合酶聚合酶（pol），），DNA聚合聚合酶酶（pol），），DNA聚合酶聚合酶（pol ），），DNA聚合酶聚合酶（pol）。）。 參與染色體參與染色體DNA復制的是復制的是pol（延長滯（延長滯后鏈）后鏈）和和pol（延長前導鏈），參與線（

20、延長前導鏈），參與線粒體粒體DNA復制的是復制的是pol，pol與與DNA損損傷修復、校讀和填補缺口有關，傷修復、校讀和填補缺口有關，pol只只在其他聚合酶無活性時才發揮作用。在其他聚合酶無活性時才發揮作用。 DNA復制的保真性：復制的保真性：為了保證遺傳的穩定，為了保證遺傳的穩定，DNA的復制必須具有的復制必須具有高保真性。高保真性。DNA復制時的保真性主要與下列復制時的保真性主要與下列因素有關：因素有關： 1遵守嚴格的堿基配對規律；遵守嚴格的堿基配對規律； 2DNA聚合酶在復制時對堿基的正確選擇；聚合酶在復制時對堿基的正確選擇； 3對復制過程中出現的錯誤及時進行校正。對復制過程中出現的錯誤

21、及時進行校正。 2、DNA解旋酶和單鏈結合蛋白解旋酶和單鏈結合蛋白復制過程中，復制叉在不斷前進，復制叉前方的親代DNA就需不斷解鏈，為使復制能夠順利進行，就必須防止DNA單鏈的鏈間或鏈內局部“退火”并保證其完整性與伸展性，使單鏈DNA處于穩定的狀態。承擔上述任務是DNA解旋酶（DNA helicase）和單鏈DNA結合蛋白（single-strand binding protein, SSB）。DNA解旋酶是很多細胞過程所要求的（如核苷酸切除修復、同源重組、轉錄終止）。DNA解旋酶是利用ATP水解獲得的能量來打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動的一類酶的總稱（又稱解鏈酶）。解

22、鏈酶的作用示意圖解鏈酶的作用示意圖單鏈單鏈DNADNA結合蛋白結合蛋白行使很多涉及單鏈區域穩定性的功能。SSB與DNA單鏈相結合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解開的單鏈DNA重新締合形成雙鏈，從而保持一種伸展狀態，以保證復制順利進行。在E.coli中SSB為四聚體，對單鏈DNA有很高的親和性，但對雙鏈DNA和RNA沒有親合力。SSB與DNA結合時有協同作用，當一個SSB與DNA結合時，就會有更多的SSB迅速結合上去擴展分布整個DNA單鏈，將DNA包被上蛋白聚合體。 單鏈單鏈DNA結合蛋白（結合蛋白（single strand binding protein, SSB）的作用為：）的作用為：

23、使解開雙螺旋后使解開雙螺旋后的的DNA單鏈能夠穩定存在，即穩定單鏈單鏈能夠穩定存在，即穩定單鏈DNA，便于以其為模板復制子代便于以其為模板復制子代DNA； 保護單鏈保護單鏈DNA，避免核酸酶的降解。，避免核酸酶的降解。 3、拓撲異構酶拓撲異構酶 天然DNA的負超螺旋雖然有利于DNA的解旋，但隨著復制的進行，復制叉前方親代DNA中仍積累巨大的張力，因此復制中需要DNA旋轉酶去除解螺旋酶的解鏈產生的扭曲張力。 大腸桿菌中的DNA旋轉酶（gyrase）又稱拓撲異構酶（topoisomerase），超螺旋：DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成的空間結構 （1）正超螺旋(positive supercoil)：

24、盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同 （2）負超螺旋(negative supercoil)： 盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反 正超螺旋：兩股以右旋方向纏繞的螺旋，在外力往緊纏的方向捻轉時，會產生一個左旋的超螺旋，以解除外力捻轉造成的脅變。這樣形成的螺旋為正超螺旋。 負超螺旋：兩股以右旋方向纏繞的螺旋在外力向松纏的方向捻轉時，產生一個右旋的超螺旋以解除外力捻轉造成的脅迫。這樣形成的超螺旋為負超螺旋. 正超螺旋 負超螺旋 天然DNA分子一般為負超螺旋 負超螺旋DNA更易于局部解鏈，易于參加DNA的復制、轉錄等拓撲異構酶拓撲異構酶oror溴化乙錠溴化乙錠拓撲異構酶拓撲異構酶oror溴化乙錠溴化乙錠DNA

25、DNA扭曲與雙螺扭曲與雙螺旋相同（擰緊）旋相同（擰緊）DNADNA扭曲與雙螺扭曲與雙螺旋相反（松開）旋相反（松開）負超螺旋負超螺旋松弛松弛DNADNA正超螺旋正超螺旋3、拓撲異構體（Topological isomer）： 具有不同連接數的相同DNA分子4、拓撲異構酶（Topoisomerase）： 能夠改變DNA連接數從而改變DNA分子超螺旋水平的酶（1）拓撲異構酶I （topoisomerase- I ） 作用機制：切開環狀一條鏈，連接數改變1，不需ATP （2）拓撲異構酶 作用機制：切開環狀兩條鏈，連接數改變2，需要ATP 結合到結合到一條鏈一條鏈上形成上形成復合物復合物切斷一切斷一條鏈

26、形條鏈形成酶和成酶和蛋白的蛋白的復合體復合體共價連接共價連接 Tyrosine-5PTyrosine-5P一條鏈一條鏈穿越穿越重新重新連接連接L=2L=2L=3L=3 拓撲異構酶拓撲異構酶 (topoisomerase I) (topoisomerase I) 拓撲異構酶拓撲異構酶Top II Top II 引入負超螺旋引入負超螺旋作用于雙鏈：涉及雙鏈的斷裂和連接每次使作用于雙鏈：涉及雙鏈的斷裂和連接每次使DNADNA的連接數改變的連接數改變2 2 DNA拓撲異構酶每作用一次產生兩個負超螺旋，因此可以消除復制叉向前移動所產生的正超螺旋，并且復制完的兩個子代DNA雙鏈的分離也需要DNA旋轉酶的催

27、化功能。 當加入DNA旋轉酶的抑制劑如香豆霉素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixic acid）等時均能抑制細菌DNA的合成。可見DNA旋轉酶是DNA復制所必不可少的。4、引發酶與引物、引發酶與引物RNA的合成的合成 DNA的半不連續復制中，DNA聚合酶不能從頭起始新的DNA鏈合成，只能在已有引物的3端向前延伸。迄今為止，人們所發現的引物大多為一段RNA，其長度和序列隨著基因組的種類而表現出不同，在大多數情況下為110個核苷酸。催化RNA引物（RNA primer）合成的酶叫引發酶（primerase）。引發酶識別DNA單鏈模板特異順序，以核

28、糖核苷三磷酸為底物合成寡聚核苷酸產生3-OH，為DNA聚合酶起始生成磷酸二酯鍵提供條件。引物與典型的RNA（如mRNA）不同，它們在合成以后并不與模板分離，而是以氫鍵與模板結合。RNA引物必須去除以完成引物必須去除以完成DNA復制！復制！RNase HDNA polymeraseDNA ligase5、DNA連接酶連接酶 DNA DNA連接酶連接酶(DNA ligase)(DNA ligase)可催化兩段可催化兩段DNADNA片段之間片段之間磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵的形成，而使兩段的形成，而使兩段DNADNA連接起來。連接起來。 DNA連接酶催化的連接酶催化的條條件件 是 ：是 ： 需 一 段需

29、一 段DNA片段具有片段具有3-OH，而另一段而另一段DNA片段具片段具有有5-Pi基基； 未封閉未封閉的缺口位于雙鏈的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈中，即其中有一條鏈是完整的是完整的； 需要消需要消耗能量，在原核生物耗能量，在原核生物中由中由NAD+供能，在供能，在真核生物中由真核生物中由ATP供供能。能。三、DNA 復制過程 復制的起始(initiation) DNA鏈的延伸(elongation) 復制的終止(termination)1. DNA復制的起始 復制起始原點 DNA雙螺旋的解旋 復制的引發DNA聚合酶只能延長已存在的DNA鏈，而不能從頭合成DNA鏈，那么，新DNA的復制

30、是怎樣開始的呢？大腸桿菌(E. coli)的OriC復制原點參與DNA復制起始和引發的蛋白質 DNA解旋酶(DNA helicase)催化DNA雙鏈的解鏈過程。 單鏈DNA結合蛋白(single strand DNA binding protein)：以四聚體形式存在于復制叉處，只保持單鏈的存在，并不能起解鏈作用。 DNA拓撲異構酶(DNA topoisomerase)消除DNA雙鏈的超螺旋堆積。 引物酶(primase)合成一小段RNA引物，為DNA新鏈的合成提供3-OH末端。2. DNA鏈的延伸DNA鏈的延伸需要的蛋白質: DNA聚合酶 滑動夾（Sliding DNA clamp） RNA

31、酶(RNaseH 等) 在復制完成后切除RNA引物。 DNA連接酶(DNA ligase)通過生成35-磷酸二酯鍵連接兩條DNA鏈。DNA polymerase catalyze DNA synthesisDNA Structureof a sliding DNA clamp Sliding DNA clamps encircle the newly replicated DNA produced by an associated DNA polymerase. Sliding clamps dramatically increase DNA polymerase processivity(持

32、續合成能力) Removal of RNA primers from newly synthesized DNARNA引物的切除引物的切除3. 復制的終止 當復制叉前移，遇到20bp重復性終止子序列（Ter）時，Ter-Tus復合物能阻擋復制叉的繼續前移，等到相反方向的復制叉到達后在DNA拓撲異構酶IV的作用下使復制叉解體，釋放子鏈DNA。四四. DNA復制的幾種主要方式復制的幾種主要方式 DNA復制通常是從雙螺旋的特定位置復制原點（ori）開始，一般是富含A-T的區段，該區段的雙鏈DNA具有較強的呼吸作用（breathing），是經常瞬間處于打開形成單鏈的區段（frequently open

33、ing region），由此產生的瞬時單鏈與SSB蛋白結合，對復制的起始十分重要。原核生物的復制原點通常為一個，而真核生物則有多個特定的復制原點。根據DNA合成的起始方式，復制可分為重新起始與共價延伸兩種類型：前者是前導鏈從新開始，也叫復制叉式復制復制叉式復制；后者是先導鏈共價結合在一條親代鏈上，也叫滾環式滾環式復制復制。復制主要以雙向等速雙向等速進行，如原核生物E.coli等及真核生物DNA的復制；部分是單方單方向進行向進行，如質粒ColE1的復制；或以不對稱的雙向方式進行，如線粒體DNA的復制。1、復制叉式復制、復制叉式復制(一一)、復制的起始、復制的起始 DNA復制的起始階段，由下列兩步

34、構成。復制的起始階段，由下列兩步構成。 1、預引發：、預引發： （ 1）解旋解鏈，形成復制叉：）解旋解鏈，形成復制叉： 由由拓撲異構酶和解鏈酶拓撲異構酶和解鏈酶作用，使作用，使DNA的超的超螺旋及雙螺旋結構解開，堿基間氫鍵斷裂，螺旋及雙螺旋結構解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈形成兩條單鏈DNA。單鏈單鏈DNA結合蛋白結合蛋白結結合在兩條單鏈合在兩條單鏈DNA上，形成上，形成復制叉復制叉。 DNA復制時，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，復制時，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結構稱為這種叉狀結構稱為復制叉復制叉。對于雙向復制而。對于雙向復制而言，形成的言，形成的兩個復制叉向相反方向行進兩個復制

35、叉向相反方向行進，每，每個復制叉上的兩條個復制叉上的兩條DNA鏈均被拷貝。鏈均被拷貝。（2）引發體組裝：）引發體組裝： 由蛋白因子（如由蛋白因子（如dnaB等）識別復制起始等）識別復制起始點，并與其他蛋白因子以及引物酶一起點，并與其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成組裝形成引發體引發體。2、引發：、引發：在引物酶的催化下，以在引物酶的催化下，以DNA為模板，合為模板，合成一段短的成一段短的RNA片段，從而獲得片段，從而獲得3端自端自由羥基（由羥基（3-OH）。）。 （二）、復制的延長（二）、復制的延長 1 1、聚合子代、聚合子代DNADNA：由由DNADNA聚合酶催化，以聚合酶催化，以3535方

36、向的親代方向的親代DNADNA鏈為模板，從鏈為模板，從5353方向聚合子代方向聚合子代DNADNA鏈。鏈。在原核生物中，參與在原核生物中，參與DNADNA復制延長的是復制延長的是DNADNA聚合聚合酶酶；在真核生物中，在真核生物中，是是DNADNA聚合酶聚合酶(延長滯延長滯后鏈后鏈) )和和DNADNA聚合酶聚合酶（延長前導鏈）。（延長前導鏈）。2、引發體移動：、引發體移動：引發體向前移動，解開新的局部雙螺旋，引發體向前移動，解開新的局部雙螺旋，形成新的復制叉，滯后鏈重新合成形成新的復制叉，滯后鏈重新合成RNA引物，繼續進行鏈的延長。引物，繼續進行鏈的延長。 （三）、復制的終止（三）、復制的終

37、止 去除引物，填補缺口：去除引物，填補缺口：在原核生物中，由在原核生物中，由DNADNA聚合酶聚合酶來水解去除來水解去除RNARNA引物，并由該酶催化延長引物缺口處的引物，并由該酶催化延長引物缺口處的DNADNA，直到剩下最后一個磷酸酯鍵的缺口。，直到剩下最后一個磷酸酯鍵的缺口。在真核生物中，在真核生物中，RNARNA引物的去除，由一種特引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片段仍由殊的核酸酶來水解，而岡崎片段仍由DNADNA聚聚合酶來延長。合酶來延長。 連接岡崎片段：連接岡崎片段：在在DNA連接酶連接酶的催化下，形成最后一的催化下，形成最后一個磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形個磷酸酯鍵

38、，將岡崎片段連接起來，形成完整的成完整的DNA長鏈。長鏈。 The composition of the DNA Pol III holoenzyme2、滾環式復制、滾環式復制 型復制是雙鏈環狀DNA以復制叉方式進行復制的特例。某些雙鏈環狀DNA或單鏈DNA的復制型（replication form, RF），在復制時，以滾環復制方式進行。 滾環復制是在一條斷裂的親本鏈的3-OH端不斷地發生DNA聚合作用，因而又稱共價延伸。由于斷開的3-OH端仍然與其互補鏈形成雙螺旋結構，因而沒有合成RNA引物的必要。合成先導鏈的模板也總是呈環狀。 滾環復制是單向復制的特殊方式，是某些噬菌體DNA復制的共同方

39、式，E.coli噬菌體（如X174、M13）的環形雙螺旋DNA復制時，僅僅以1條鏈作為模板合成若干環形DNA分子拷貝； 某些雙鏈DNA的合成也可以通過滾動環的復制方式進行，例如，噬菌體復制的后期以及真核生物如非洲爪蟾卵母細胞中rDNA基因的擴增都是以這種方式進行的。 Rolling circles produce multimersof a replicon線粒體線粒體DNA的的D-嚕噗復制嚕噗復制 雙鏈環狀DNA中的一條前導鏈已經引發并開始合成，與其模板形成雙鏈結構，而另一條親本鏈則被前導鏈置換出來成為單鏈狀態。這種由一條單鏈和一條雙鏈組成的三元泡狀結構，叫做置換嚕噗或D-嚕噗（displa

40、cement loop）。只有前導鏈將另一條親本鏈（即滯后鏈的模板）的特別序列置換出來成為單鏈形式，才能產生滯后鏈前體的引發并合成其互補鏈。DNA復制的不同方式 3 3、真核生物端粒的形成：、真核生物端粒的形成： 端粒端粒（telomeretelomere）是指真核生物染色體）是指真核生物染色體線性線性DNADNA分子末端的結構部分，通常膨大分子末端的結構部分，通常膨大成粒狀。其共同的結構特征是由一些富成粒狀。其共同的結構特征是由一些富含含G G、C C的短重復序列構成，可重復數十的短重復序列構成，可重復數十次至數百次。次至數百次。 端粒結構 Telomeres 端粒是線狀染色體末端的DNA重

41、復序列。 端粒是線狀染色體末端的一種特殊結構，在正常人體細胞中，可隨著細胞分裂而逐漸縮短。把端粒當作一件絨線衫袖口脫落的線段，絨線衫像是結構嚴密的DNA，排在線上的DNA決定人體性狀。 與人頭發的直與曲，眼睛的藍與黑，人的高與矮等等，甚至性格的暴躁和溫和有關。原核生物的末端問題在原核生物中： 如果是環狀的DNA雙鏈雙向復制，RNA引物切除后不管是前導鏈還是滯后鏈都可以通過3末端的延伸首尾相連把GAP補上（如大腸桿菌）；不存在末端問題 如果是線狀的DNA雙鏈，會在復制時從線狀轉換成環狀或發夾結構來避開末端復制的問題（如T4噬菌體和草履蟲的線狀線粒體DNA）。 在真核生物中： 對于前導鏈來說，因為

42、真核生物的復制是從復制叉向兩個方向復制的，前導鏈的切去的RNA的部分，可以被復制叉另外一個方向的后隨鏈補平，不存在末端問題 而對于滯后鏈來說，其5端就是通過端粒酶來完成末端復制了。 真核生物的末端問題只有后隨鏈才有末端問題，前導鏈不存在末端問題，為什么？端粒的結構與功能 1972年James Watson提出了“復制末端問題”，復制DNA的DNA多聚酶并不能將線性染色體末端的DNA完全復制。也就是說在線性DNA復制時，DNA多聚酶留下染色體末端一段DNA（一段端粒）不復制。 端粒DNA復制的特點是在每次DNA 復制中，每條染色體的3端均有一段DNA無法得到復制，隨著細胞每次分裂，染色體3一末端

43、將持續喪失50-200bp的DNA，因而細胞分裂具有一定的限度，即分裂壽命。所以端粒的長度可作為細胞的“分裂時鐘”，反映細胞分裂能力。 端粒酶的結構 端粒酶在結構上為一核糖核蛋白復合體,由RNA 和結合的蛋白質組成,是RNA依賴的DNA 聚合酶。它是一種特殊的能合成端粒DNA的酶,通過明顯的模板依賴方式每次添加一個核苷酸。 端粒酶實質上是一種特殊的逆轉錄酶 端粒酶RNA(hTR) 端粒酶逆轉錄酶（TERT） 端粒酶結合蛋白（TEP） 端粒酶端粒酶RNA(hTR)RNA(hTR)端粒酶逆轉錄酶（端粒酶逆轉錄酶（TERTTERT）端粒酶結合蛋白（端粒酶結合蛋白（TEPTEP）端粒酶端粒酶RNARN

44、A是第一個被克隆的端粒酶是第一個被克隆的端粒酶組分。端粒酶組分。端粒酶RNARNA含有與同源端粒含有與同源端粒DNADNA序列序列TTAGGGTTAGGG的互補序列的互補序列, ,核糖核酸酶核糖核酸酶H H切割此模板區切割此模板區, ,能使體外消除端粒酶能使體外消除端粒酶延長端粒的功能。延長端粒的功能。人類人類TERTTERT（hTERThTERT）基因為一單拷貝基因）基因為一單拷貝基因, ,定位于定位于5p15. 33 ,5p15. 33 ,具有具有7 7個保守序列結構域單元和端粒酶特異性結構域單元個保守序列結構域單元和端粒酶特異性結構域單元T T。破壞破壞TERT TERT 將消除端粒酶活

45、性并致端粒縮短。將消除端粒酶活性并致端粒縮短。TEP1TEP1、生存動力神經細胞基因、生存動力神經細胞基因(SMN) (SMN) 產物、產物、 hsp90hsp90 、 PinX1PinX1、 Est1p Est1p 和和Est3pEst3p 線性線性DNADNA在復制完成后，其末端由于引在復制完成后，其末端由于引物物RNARNA的水解而可能出現縮短。故需要的水解而可能出現縮短。故需要在在端粒酶端粒酶（telomerasetelomerase）的催化下，進）的催化下，進行延長反應。行延長反應。 端粒酶是一種端粒酶是一種RNA-RNA-蛋白質蛋白質復合體，它可復合體，它可以其以其RNARNA為模

46、板，通過為模板，通過逆轉錄逆轉錄過程對末過程對末端端DNADNA鏈進行延長。鏈進行延長。 端粒酶端粒酶(telomerase)的作用機制的作用機制轉轉 座座 TranspositionDNA的轉座的轉座基本概念：轉座子最先由轉座子最先由Barbara Barbara McClintockMcClintock于于2020世紀世紀4040年代在玉米遺傳學年代在玉米遺傳學研究時發現的。研究時發現的。DNADNA的轉座的轉座：由可移位因子介導的遺傳物質重排現象。：由可移位因子介導的遺傳物質重排現象。轉座子轉座子（transposon, Tntransposon, Tn）是存在于染色體）是存在于染色體D

47、NADNA上可自主上可自主復制和移位的基本單位。復制和移位的基本單位。 轉座子存在于所有生物體內，人類基因組中有約35%以上的序列為轉座子序列，其中大部分與疾病有關。轉座子分為兩大類：1. 1. 轉座子的分類和結構特征轉座子的分類和結構特征1 1. . 插入序列插入序列（insertional sequence, ISinsertional sequence, IS）2. 2. 復合型轉座子復合型轉座子（composite transposoncomposite transposon） 最簡單的轉座子，不含任何宿主基因。它們是細菌染色體或質粒DNA的正常組成部分。 一個細菌細胞常帶有少于10個IS序列。 轉座子常被定位到特定的基因，造成該基因突變。插入序列（插入序列（ISIS因子）因子）IS因子的特征：很小的DNA片段末端具有倒置重復序列 (反向互補)復制宿主靶位點DNA（4-15bp）可獨立存在，帶有介導自身移動的蛋白，可作為其他轉座子的組成部分.特征：復合型轉座子兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列,表明IS序列插到功能基因的兩端就可能產生復合型轉座子。復合型轉座子復合型轉座子是一類帶有某些抗是一類帶有某些抗藥性基因（或其它宿主基因）的藥性基因（或其它宿主基因）的轉座子。轉座子。復合型