1、動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)一、目的要求一、目的要求掌握瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的操作和判定標(biāo)準(zhǔn)。明確此試驗(yàn)在生產(chǎn)中的應(yīng)用。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)二、儀器材料二、儀器材料瓊脂平板、瓊脂打孔器、生理鹽水、禽流感瓊脂擴(kuò)散抗原、禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、被檢血清、pH7.2、0.01mol/LPBS。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù) 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 以禽流感瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)為例(選自GB/T189362003略有改動(dòng))三、方法與步驟三、方法與步驟瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù) （1）瓊脂板的制備 稱取瓊

2、脂糖1.0g，加到100 mL pH 7.2、0.01mol/L PBS中，在水浴中煮沸或用電爐煮沸充分融化，加入8g氯化鈉，充分溶解后加1硫柳汞溶液1mL。冷至4555時(shí)，將潔凈干熱滅菌直徑為90mm的平皿置于平臺(tái)上，每個(gè)平皿加入1820mL，加蓋待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸發(fā)，放普通冰箱（4）中保存?zhèn)溆茫ū４鏁r(shí)間不超過2周）。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù) （2 2）操作）操作打孔打孔 在制好的瓊脂板上按7孔一組的梅花形打孔(中間1孔，周圍6孔)，孔徑5mm，孔距25mm，將孔內(nèi)的瓊脂用注射針頭斜面向上從右側(cè)邊緣插入，輕輕向左側(cè)方向?qū)傊舫觯饌?/p>

3、緣或使瓊脂層脫離皿底。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù) （2 2）操作）操作封底封底 用酒精燈輕烤平皿底部至瓊脂板底部剛剛要溶化（手背感覺微燙手）為止，封閉孔底部，以防側(cè)漏。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù) （2 2）操作）操作 加樣加樣 用微量移液器或帶有67號(hào)針頭的0.25ml注射器，吸取抗原懸液滴入中間孔，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清分別計(jì)入外周的1和4孔，被檢血清按編號(hào)順序分別加入另外4個(gè)外孔。每孔均以加滿不溢出為度，每加一個(gè)樣品應(yīng)換一個(gè)滴頭。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù) （2 2）操作）操作 反應(yīng)反應(yīng)（擴(kuò)散） 加樣完畢后，靜置510min，然后將平皿輕輕倒置放入濕盒內(nèi)，37溫箱中作用，分別在24h、48h、72h觀察并記錄結(jié)果。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù) 2. 2.瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) （3 3）結(jié)果判定）結(jié)果判定判定方法判定方法 將瓊脂板置日光燈或側(cè)強(qiáng)光下觀察，若標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與抗原孔之間出現(xiàn)一條清晰的白色沉淀線，則試驗(yàn)成立。判定標(biāo)準(zhǔn)判定標(biāo)準(zhǔn) 若被檢血清孔與中心抗原孔之間出現(xiàn)清晰致密的沉淀線，且該線與抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清之間沉淀線的末端相吻合，則被檢血清判為陽性。若被檢血清孔與中心孔之間不出現(xiàn)沉淀線，且標(biāo)準(zhǔn)血