1、HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT分子生物學實用技術抗 體 技 術第一頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第二頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT免疫學的科學早期 (19世紀(shj)中葉-1912年) 血清療法： 1890年德國的貝林(Emil von Behring)和同事日本(r bn)學者北里柴三郎(Kitasato)用白喉及其破傷風外毒素免疫動物，所獲得動物血清可中各或破壞其毒素作用，并且可預防由毒素所導致疾病的發生。隨后，被稱之為“抗血清”。貝林貝林 E.,Behring1854-19171901年獲諾貝爾生理學及醫

2、學獎第三頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT埃利希. P. (Paul Ehrlich, 1854-1915)德國細菌學家、免疫學家 1908年獲諾貝爾生理學及醫學獎 最早用化學反應解釋免疫過程。第一個定量地研究了毒素與抗毒素的沉淀反應，建立起抗體理論。由于他的研究，后來科學家才開始(kish)使用“免疫化學”這個名詞，因此他被譽為免疫化學的先驅。第四頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT埃德爾曼.G.M. (Gerald Maurice Edelman, 1929-)美國(mi u)生物化學家 1972年獲諾貝爾生理學及醫學獎 主要闡明了

3、抗體分子結構，對生物化學和免疫學研究作出了重大貢獻。 1969年4月，在美國實驗生理學學會聯合會第53次年會上，Edelman正式宣布：自己已解決抗體分子最詳盡的化學結構即其氨基酸序列問題。與會者一致認為：這項研究成果“是解決抗體分子三維結構問題至關重要的一個(y )步驟，是一項重大成就，它必將對進一步了解抗體的功能發揮巨大的作用。第五頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT波特(b t). R.R. (Rodney Robert Portel, 1917-1986)英國生物化學家 1972年獲諾貝爾生理學及醫學獎 首次(shu c)提出抗體四肽鏈結構，為闡明 抗體的結

4、構和它的特異性之間的貢 獻，提供了極重要的證據。 是分子免疫學的創始人之一。 是Fc、Fab和重鏈與輕鏈的發現者。第六頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT 因開發了放射免疫分析法，1977年獲得諾貝爾生理學及醫學獎。 發現在用胰島素治療糖尿病時，可使機體產生抗胰島素的抗體。但是這一重要研究成果開始并未得到大家的承認，因為人們認為象胰島素這樣的小分子并不能刺激機體產生抗體。柏森（1972年逝世）和Yalow接著研究發現，向免疫復合物（由標記的胰島素及其相應(xingyng)抗體形成）中加入過量的未標記胰島素時可使部分的胰島素被取代。雅洛. R. (Rosalyn Ya

5、low, 1921-2011)美國(mi u)物理學家 1977年獲諾貝爾生理學及醫學獎第七頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT 研究病毒學和免疫學的專家(zhunji) 是世界上研究流行性感冒、白血病和病毒性疾病的權威。提出了間接模板學說和獲得性免疫的無性繁殖系選擇學說，對于臨床醫學、免疫學及分子遺傳學具有極其重要的意義。 在免疫學理論上的建樹是十分巨大的，他的理論假說對后繼免疫學研究產生了深遠而重大影響。在免疫學理論上，目前尚未見比他起到更大歷史影響作用的研究者。伯內特. F.M. (Frank Macfarlane Burnet, 1899-1985)澳大利亞

6、(o d l y)免疫學家 1960年獲諾貝爾生理學及醫學獎第八頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT 他與與著名生物化學家米爾斯坦共同研究開發出一套制備單克隆抗體的新技術，被譽為上世紀70年代醫學(yxu)和生物學領域的一個革命。 他們1973年開始研究單克隆抗體。1975在英國劍橋醫學研究會研究出一種新技術，可使鼠細胞與人類細胞融合，產生一種被稱為“雜交瘤”的細胞。對這種雜交瘤細胞進行無性繁殖，即可產生大量抗感染的抗體。科勒. G. (Georges Kohler, 1946-1996)德國免疫學家 1984年獲諾貝爾生理學及醫學獎第九頁，共一百二十三頁。HGPR

7、T-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT 1975年他們(t men)將適應于組織培養的小鼠骨髓瘤細胞與免疫小鼠的脾細胞融合，獲得了能分泌與免疫原起反應的抗體的雜交瘤細胞株。這種雜交瘤細胞株既有骨髓瘤細胞的永生性（能在組織培養中大量增殖），又能分泌大量的單克隆抗體。米爾斯坦. C. (Cesar Milstein, 1927-)生物(shngw)化學家（英國和阿根廷雙重國籍）1984年獲諾貝爾生理學及醫學獎第十頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT是現代免疫學之父，為現代免疫學的建立奠定了基礎。 提出了三個學說： 抗體形成的“天然”選擇學說； 有關(yugun)抗體多樣性

8、發生的學說； 免疫系統的網絡學說。杰尼. N.K. (Niels K. Jerne, 1911-)丹麥(dn mi)免疫學家 1984年獲諾貝爾生理學及醫學獎第十一頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT 一、抗體一、抗體(kngt)相關理論相關理論第十二頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT抗體（抗體（antibody, Abantibody, Ab） 機體免疫細胞被抗原激活后，由分化成熟的終末B細胞-漿細胞合成(hchng)、分泌的一類能與相應抗原特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。第十三頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-

9、HGPRT（一）抗體（一）抗體(kngt)的發現的發現n早在19世紀后期，Behring和Kitasato就發現用白喉或破傷風毒素免疫動物后產生一種可以中和毒素的物質，稱之為抗毒素（antitoxin）。后引入“抗體”一詞泛指抗毒素類物質。n1939年Tiselius和Kabati證實抗體為球蛋白。n1968年和1972年世界衛生組織和國際(guj)免疫學會聯合會的專門委員會先后決定：將具有抗體活性或化學結構與抗體相似的球蛋白統稱為免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）。n免疫球蛋白可分為分泌型（secreted Ig, SIg）膜型（membrane Ig, mIg）兩種。Sig

10、存在于備注及組織洲中，具有抗體的各種免疫功能；mIg是B細胞表面的抗原受休。第十四頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT抗體生成理論(lln) 1897年 側鏈學說 1930年 模板學說 1941年 間接模板學說 1955年 自然選擇學說 1958年 克隆選擇學說第十五頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（二）抗體（二）抗體(kngt)的結構的結構(1) 重鏈（heavy chain，H） 2條 輕鏈（light chain，L） 2條(2) 可變區（variable region, V區） 恒定區（constant region, C區）

11、(3) 超變區（ hyper-variable region, HVR), 又稱互補決定區(complementary determining region, CDR） 骨架(gji)區（framework region, FR）(4) 鉸鏈區（hinge region）第十六頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第十七頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT可變區恒定(hngdng)區（Variable and constant regions）第十八頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRTnHypervariable

12、 region, HVR (1, 2, 3) (高可變區)Framement region, FR (1,2,3,4) (骨架區)Complementarity determining region, CFR (1,2,3) (互補決定(judng)區)Antigen-binding site (抗原結合部位)第十九頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（三）抗體（三）抗體(kngt)的功能區的功能區 Ig的多肽鏈分子可折疊成幾個由鏈內二硫鍵連接的球形結構(jigu)，每個球形結構(jigu)由約110個氨基酸殘基組成，并代表一個功能區。第二十頁，共一百二十三頁。HG

13、PRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第二十一頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（四）抗原（四）抗原(kngyun)抗體結合的基礎抗體結合的基礎 抗體對抗原的結合是一種典型的特異性免疫(miny)結合，抗體結合抗原的部位位于Fab片段可變區結構域中的CDR區。第二十二頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第二十三頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（五）抗體（五）抗體(kngt)基因的遺傳控制基因的遺傳控制完整的抗體分子(fnz)由輕鏈（包括和）基因和重鏈基因編碼。 編碼一條免疫球蛋白多肽鏈的基因是由胚系中分

14、隔開的基因片段經重排而形成的。即免疫球蛋白的可變區和恒定區是由分隔存在的基因所編碼，在淋巴細胞的發育過程中，這兩個基因因為發生易位而重排在一起形成編碼完整免疫球蛋白分子的基因。第二十四頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT 免疫球蛋白基因(jyn)的染色體定位 人 鼠 重 鏈 14q32 12F1 kappa 鏈 2p12 6c2 lambda鏈 22q11 16第二十五頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT重鏈可變區基因(jyn)的重排第二十六頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT鏈基因(jyn)的重排第二十七頁，

15、共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT鏈基因(jyn)的重排 第二十八頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（六）抗體（六）抗體(kngt)多樣性機制多樣性機制（1）編碼Ig基因的多樣性（2）體細胞突變（3）V、D、J基因連接的多樣性（4）H鏈和L鏈相互隨機(su j)配對第二十九頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT 二、抗體二、抗體(kngt)技術技術第三十頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT抗體的產生(chnshng)有三種條途徑：經典途徑：即免疫動物產生多克隆抗體（抗 血清）；細胞工程

16、途徑：即運用雜交瘤技術產生單克 隆抗體；利用基因工程途徑表達和改造抗體。第三十一頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT抗體(kngt)種類：第一代抗體：多克隆抗體 polyclonal antibody第二代抗體：單克隆抗體 monoclonal antibody第三代抗體：基因工程抗體 genetic engineering antibody第三十二頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（一）B淋巴細胞雜交瘤技術制備(zhbi)單克隆抗體克隆：細胞集落單克隆：一個(y )無性繁殖細胞集落單克隆抗體：一個B細胞無性繁殖所產生的抗體 特點：一種

17、抗體，性質、結構均一雜交瘤：淋巴細胞+骨髓瘤細胞=融合=雜交瘤細胞 特點：繼承淋巴細胞產生抗體 繼承瘤細胞在體外長期培養第三十三頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第三十四頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT1.免疫(miny)原和免疫(miny)程序(1)顆粒性抗原：細胞、微生物等 表面抗原一般有較高的免疫原性，不加佐劑。如細胞抗原一般以1-2 107 細胞腹腔(fqing)注射。(2)可溶性抗原：蛋白質類 一次劑量為10-100ug，需加佐劑。第三十五頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT(3) 弱抗原：多肽

18、、糖類、類固醇等 與蛋白交聯，如白蛋白、KLH等(4) 微量抗原：常采用特殊的免疫(miny)方法 體外免疫 10-100ng/ml 脾內一次注射 20ug(蛋白抗原)， 2.5 105 (細胞)程序： 常規 0、21、42天免疫，52天試血， 融合前3天加強免疫 快速 0、14、28天免疫，38天試血， 融合前3天加強免疫第三十六頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第三十七頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRTMcAb and PcAb第三十八頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRTMcAb與PcAb的比較(bji

19、o)McAbPcAb抗原要求可以不純純度高得量高低特異性高低穩定性低高沉淀反應無有成本高低第三十九頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT2.培基的配制(pizh)n基礎(jch)培基：DMEM RPMI1640n選擇性培基：HAT培基n谷氨酰胺、丙酮酸鈉n血清：小牛血清（需篩選）n完全培基第四十頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT3. 融合(rngh)用細胞（1）骨髓瘤細胞(xbo)n不產生Ig的重鏈和輕鏈nHGPRT-;TK-n與提供淋巴細胞的動物品系相同 種類：小鼠骨髓瘤細胞 SP2/0 無Ig 缺乏HGPRT NS-1 k 缺乏HGP

20、RT 大鼠骨髓瘤細胞 Y3-Ag1.2.3 抗體得量較高 人骨髓瘤細胞 SK007 培養技術較困難第四十一頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT培養 n選擇對數生長期的細胞進行傳代和融合 細胞106/ml 細胞老化n 避免返祖：返祖即重新獲得HGPRT 細胞用15-20ug/ml 8-氮鳥嘌呤處理n 不要過多傳代第四十二頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（2）免疫脾細胞n目的 取得分裂(fnli)活躍并能產生特異性抗體的B細胞，增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤頻率。n來源 A. 小鼠脾臟：Balb/c 8-12周齡 B. 大鼠脾臟： C.

21、人：外周血淋巴細胞、淋巴結、扁桃體第四十三頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（3）飼養細胞 n定義(dngy) 能夠支持其它細胞生長的細胞。n來源 A. 小鼠的腹腔細胞 B. 大鼠的胸腺細胞n 作用 A. 產生非種屬特異性生長因子 B. 吞噬壞死細胞第四十四頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT4. 細胞融合(1)方法 A. PEG法 B. 自發觸發(chf) C. 仙臺病毒 D. 受體指引法 E. 電融合法 F. 激光法 G. 磁場融合第四十五頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT(2)整個過程A.飼養細胞的制

22、備(融合前一天) 小鼠 消毒固定 暴露腹膜 注入Hanks 按摩 抽出 無血清培基洗一次 計數(2105 /ml) B.骨髓瘤細胞 復蘇(前7天 ) 擴增 收集細胞(對數(du sh)生長期) 計數及活力測定(活率 95%，總數 10 7 )第四十六頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRTC.免疫(miny)脾細胞的制備加強免疫后3-4天免疫鼠 眼框放血 血清供檢測用 處死消毒，無菌取出脾臟 制備單細胞懸液 50ml離心管靜止5-10分鐘 吸上清于另一50ml離心管，1000rpm，10分鐘 計數，活力測定。第四十七頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-

23、HGPRTD. PEG作用機理：使細胞膜脂類分子在結構上發生重排， 細胞膜容易(rngy)被打開，最終引起細胞融合。作用特點：隨機發生的，不同廠商、批號、分子量的PEG， 其純度與毒性有所不同MW：600，1000，1500，4000，6000 MW 融合率 細胞毒性 配制：PEG，8磅15分鐘；50 時加等量無血清培基(50%,W/V)。 30% 融合率低 50% 毒性 第四十八頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRTE.細胞融合a.試劑、培基，37水浴。b.脾細胞、骨髓瘤細胞混合，1-10：1。c.1000rpm，10分鐘。d.輕彈離心管底部，使兩種細胞充分混勻成糊

24、狀。e.加50%PEG 0.5ml (在37水浴中、邊加邊輕彈、1分鐘內加完）。f.靜置90秒(37水浴)。g.滴加15ml無血清DMEM(37預熱)，2分鐘內加完。h.1000rpm，10分鐘，棄上清。i.加完全培基或HAT培基，調整(tiozhng)細胞濃度5 105 /ml。j.加入含飼養細胞的細胞板，每孔0.1ml。第四十九頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT5.選擇性培養(piyng)(1)目的 脾細胞(xbo) 骨髓瘤細胞 雜交瘤細胞 (2) 原理 HGPRT酶與TK酶： 次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶 胸腺嘧啶核苷激酶第五十頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK

25、-雜交瘤細胞Ig-HGPRTHAT培養基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成(hchng)主要途徑 T (Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA第五十一頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT 核酸核酸(h sun)合成途徑合成途徑 HGPRTH 主要合成途徑糖、氨基酸 DNA A阻斷T TK第五十二頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT PEG 脾細胞脾細胞(xbo) 骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞(xbo)Ig+、HGPRT+、TK+ I

26、g-、HGPRT-、TK+ 雜交瘤細胞雜交瘤細胞 Ig+、HGPRT+、TK+ HAT 7天死亡天死亡 HAT 死亡死亡 存活存活第五十三頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT(3)方法(fngf) A. 換液：2-3天換一次（半量換液） 7天內：HAT 7-14天：HT 14天后：完全培基 B. 觀察第五十四頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT 脾細胞 SP2/0 飼養細胞 雜交瘤細胞0天 良好 良好 良好 可見融合細胞1-2天 開始死亡 銳減 良好 成2-3個亮細胞3-4天 大部死亡 幾乎(jh)完全死亡 良好 成簇3-5, 10個細胞

27、5-7天 死亡 死亡 變性 100 細胞成小島7-14天 1/3-1/5孔底第五十五頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT6.雜交瘤細胞(xbo)的篩選(1)選擇篩選方法的原則 A. 快速(kui s)簡便 B. 敏感性高 C. 特異性好 D. 方法穩定(2)步驟 A.篩出能分泌與預定抗原起反應的單抗 的雜交瘤細胞 B.篩出有預定特異性的雜交瘤細胞 C.篩出可供實際應用，具有穩定生長和 功能特性的均一后代的克隆第五十六頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT(3)方法(fngf) 常用的方法：固相放射免疫測定 固相酶免疫測定 免疫熒光技術 間接

28、血凝試驗 微量細胞毒試驗 斑點試驗第五十七頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRTELISAELISA第五十八頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT。免疫熒光法免疫熒光法第五十九頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT7.克隆(k ln)化(1)目的 選育出穩定而同源的細胞系，淘汰遺傳不穩定的雜交瘤細胞。(2)方法 有限稀釋法 顯微(xin wi)操作法 軟瓊脂平板法 細胞選分儀法第六十頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT有限(yuxin)稀釋法特點(tdin)：不需任何特殊設備克隆出現效率高

29、實驗室常用方法方法：細胞懸液通過系列稀釋每個培養孔含0.51個細胞第六十一頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRTFACS：效率(xio l)最高價格昂貴第六十二頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT有限稀釋法(1)含飼養細胞的96孔細胞板。(2)陽性(yngxng)克隆稀釋成50、10、5細胞/ml。例：假定細胞濃度為3.5 10 5細胞/ml 0.1ml+培基3.4ml 10 4細胞/ml A A0.1ml+培基9.9ml 10 2細胞/ml B B1.0ml+培基1.0ml 50細胞/ml C C1.0ml+培基9.0ml 10細胞/ml

30、 D D2.0ml+培基2.0ml 5細胞/ml E第六十三頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT(3)每3-5天換培基一次。換培基前，先觀察每孔中有無細胞“集落”？是一個還是多個？作出標記。(4)7-9天后，細胞克隆長至孔底的1/3-1/2時，取上清進行篩選，檢測有無特異性抗體存在(cnzi)。(5)陽性孔轉種24孔細胞板擴增，及時檢測、做第二次有限稀釋、凍存。第六十四頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT8.凍存和復蘇(f s)1.凍存（1）目的：保證細胞(xbo)不致因傳代污染而丟失 避免多次傳代發生變異丟失染色體 防止非分泌細胞的過度

31、生長 防止細胞密度過高而死亡第六十五頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（2）方法：液氮保存（-196 ） 配制(pizh)方案：雜交瘤細胞（15）x106/ml) + 細胞凍存 液(30% 40% 牛血清，50%60% RPMI- 1640培養液，10%DMSO ) 分裝 “慢凍”：分步冷凍，30-70液氮 2.復蘇 “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、 復蘇第六十六頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT9.污染(wrn)和控制污染的微生物主要有： 細菌、酵母菌、霉菌、支原體等。預防：(1)培基中加適當濃度的抗生素。 (2

32、)器皿消毒徹底，無菌操作(cozu)嚴格。 (3)環境減少空氣對流。處理：對重要的雜交瘤細胞污染后的挽救。第六十七頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT10.單抗的制備(zhbi)(1)決定抗體產生的因素 Y=A C V每個細胞的抗體產量(chnling)A 一般：75-600個抗體分子/細胞/秒 鼠-鼠：50ug/ml 人-鼠：5-25ug/ml 人-人：0.25-10ug/ml產生抗體的細胞濃度C 取決于總的細胞濃度及分泌抗體細胞的%。第六十八頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（2）體內產生單抗A. 小鼠預處理： 石蠟油、降植烷等，腹

33、腔(fqing)注射。B. 攻瘤： 預處理1周-2月內，用雜交瘤細胞攻擊。 510 5 -10 6/ 只。C. 采集腹水： 7-10天，小鼠腹部脹大，用注射器抽取腹水， 5-8ml/次，離心取上清，分裝保存。第六十九頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT腹腔(fqing)注射法第七十頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（3）體外產生單抗A.含血清培養法 a. 靜止培養法：10-50ug/ml b. 旋轉培養法：100ug/ml c. 中空纖維：5mg/mlB.無血清培養法優點：節約血清、不要純化、減少過敏反應。成分：基礎培基（DMEM/RP

34、MI1640） 血清替代(tdi)因子（激素、生長因子，結 合蛋白，貼壁因子，微量元素等）第七十一頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT(4) 新培養方法 A. 牛淋巴液體外循環培養法 B. 微囊培養法 C. DNA重組(zhn z)的細菌發酵法第七十二頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT11.單抗的特性(txng)和純化(1)理化性質 單抗IgG 多抗IgG56 30min 完全失活 有活性63 1hr內 10min內聚合 不被PEG沉淀 30min沉淀pH pH6-8穩定(wndng) pH6-10穩定 pH8不穩定IEF電泳分析 三條

35、區帶 20+條第七十三頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT(2) 優缺點優點(yudin)：（1）特異性高 （2）均一性 （3）可重復性 （4）永生性 （5）效價高缺點：（1）太單一，對熱、pH不穩定 （2）半衰期較短 （3）可能含有病毒第七十四頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT(3)純化單抗的純花取決于實際應用(yngyng)的要求和單抗的類型。1.初步：硫酸銨沉淀法2.IgG：正辛酸法、SPA親和層析法、DEAE離子交換層析法等。3.IgM：羥基磷灰石柱層析、SephadexG-200 、SephacrylS-300等。第七十五頁，

36、共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT鹽析沉淀親和層析離子交換(l z jio hun)層析McAb的純化(chn hu)第七十六頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（二）基因工程(jyn gngchng)抗體 基因工程（genetic engineering antibody）抗體興起于80年代對鼠源性單克隆抗體（McAb）的人源化改造。 這一技術是將對Ig基因結構與功能的了解與DNA重組技術相結合，根據研究者的意圖采用基因工程方法，在基因水平對Ig分子進行切割、拼接或修飾(xish)，甚至是人工全合成后導入受體細胞表達，產生新型抗體，也稱為

37、第三代抗體。 第七十七頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT基因工程抗體(kngt)的優點與單克隆抗體相比，基因工程抗體具有如下優點：n通過基因工程技術的改造，可以降低甚至消除人體對抗體的排斥反應。n基因工程抗體的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進入病灶(bngzo)的核心部位。n根據治療的需要，制備新型抗體。n可以采用原核細胞、真核細胞和植物等多種表達方式，大量表達抗體分子大大降低生產成本。第七十八頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT基因工程抗體(kngt)制備的基本步驟 1. Ig可變區基因的克隆 2. 抗體基

38、因的修飾及表達載體的構建 3. 抗體基因的表達與篩選鑒定第七十九頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT基因工程基因工程(jyn gngchng)抗體分類抗體分類嵌合抗體改型抗體 基本類型小分子抗體噬菌體抗體催化抗體抗原化抗體雙特異性抗體抗體融合(rngh)蛋白胞內抗體第八十頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第八十一頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT1、嵌合、嵌合(qin h)抗體抗體方法： 從雜交瘤細胞分離出功能性可變區基因(jyn)，與人Ig恒定區基因連接，插入適當表達載體，轉染宿主細胞，表達人-鼠嵌合抗體

39、特點： 減少了鼠源性抗體的免疫原性 保留了親本抗體特異性結合抗原的能力 第八十二頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第八十三頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT基本原理基本原理 從雜交瘤細胞/淋巴細胞基因組中分離和鑒別出功能性的VL和VH基因，分別與人的輕、重鏈恒定區基因相連接，插入適當(shdng)的載體中，構建成人鼠嵌合的重鏈和輕鏈基因，然后共轉染骨髓瘤細胞，使之表達嵌合抗體。 第八十四頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第八十五頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT優點優點（1）

40、用人源Fc段替代鼠源Fc 段，可在一定程度(chngd)上減少體內治療時所誘導的抗異種球蛋白反應。（2）因為抗體重鏈C區所代表的免疫球蛋白同種型（包括類和亞類）的差異可影響抗體的體內功能，如產生CDC、ADCC及免疫調理作用等，所以在構建嵌合抗體時，可有目的地改變抗體的類型或亞類，增加體內治療的效果。第八十六頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT2、改型抗體、改型抗體(kngt)定義：指利用基因工程技術，將人抗體可變區（V）中互補決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構成既具,有鼠源性單抗的特異性又獲得人抗體親和力的移植抗體（CDR-grafted anti

41、body），也稱為改形抗體或重構型抗體（reshaping antibody）。 意義：多種特異的鼠源單抗有可能應用(yngyng)于臨床治療第八十七頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第八十八頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT構建構建(u jin)改形抗體的一般性原則改形抗體的一般性原則1. VH和VL的序列均應盡可能選自人的同一種Ig，以減少兩條鏈裝配的不親和性。2. 在選用人的Ig序列時，應選用其可變區氨基酸序列與鼠源McAb可變區氨基酸序列同源性最大的Ig，以盡量減少McAb的CDR插入人的FR時影響CDR的構象。3. 用計算機

42、構建鼠源McAb的分子模型，可以發現FR中有一些氨基酸殘基與CDR靠得很近，有可能影響CDR構象。還有一些FR的氨基酸殘基直接與抗原接觸。如果(rgu)這氨基酸殘基在人、鼠間不同，則一致改為鼠的殘基。第八十九頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT4. 所選用的人Ig可變區中含有一些不常用的氨基酸殘基，在改形抗體中則改為Ig通用的殘基。 5. 有些FR序列在進化上具有高度保守性，人、鼠Ig之間輕鏈FR2、FR3、和FR4，重鏈的FR1、FR3、和FR4都有完全相同的序列。輕鏈FR1中有一種序列只有一個殘基不同，重鏈FR3中有一種序列只有兩個殘基不一致。利用這些(zhxi

43、)序列不僅可能使抗原性降到最低限度，而且可能保持原抗體的親和性。6. 為提高抗體的親和性，可以把CDR中與抗原表面最靠近的帶靜電的殘基換成不帶電的親水殘基，從而使抗體與抗原之間更緊密地結合。 第九十頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT3 3、小分子、小分子(fnz)(fnz)抗體抗體nFabn單鏈抗體n單域抗體n最小結合(jih)單位第九十一頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（1）Fab 由重鏈VH加CH1及完整的輕鏈構成，大小(dxio)為完整抗體的1/3。第九十二頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT木瓜木

44、瓜(m (m u)u)蛋白酶水解蛋白酶水解第九十三頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第九十四頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（2）單鏈抗體(scFv)抗體可變區的重鏈和輕鏈（VH和VL）通過(tnggu)連接肽（約15-25個氨基酸）連接而成的重組蛋白，即VH-Linker-VL。它是抗體與抗原結合的最小單位，其分子大小僅為完整抗體的1/6。 第九十五頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT完整(wnzhng)抗體scFv第九十六頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT特點特點具有與原

45、親本抗體相同的特異性；分子量小，可迅速滲透至腫瘤(zhngli)內部或其他靶組織；避免了Fc段引起的非特異性細胞毒性及免疫原性；制備流程簡單。第九十七頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第九十八頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT小分子抗體的主要應用領域小分子抗體的主要應用領域n靶向載體n構建其它工程抗體n細胞內抗體(intrabody)：將小分子抗體基因導入細胞內，使其在細胞內特定部位表達，通過(tnggu)與靶抗原的結合影響其生物學活性。第九十九頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT4、雙特異抗體、雙特異抗體

46、 它有兩個抗原結合部位可分別結合兩種不同的抗原表位，其中一個臂可與靶細胞(xbo)表面抗原結合，另一個臂則可與效應物（如藥物、效應細胞(xbo)等）結合，從而將效應物直接導向靶組織細胞(xbo)。 第一百頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT化學交聯BsAb 分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價抗體，再使兩種不同抗原(kngyun)特異性的單價抗體通過化學試劑交聯起來，然后分離出目的組分。 此法缺點是容易導致抗體失去活性，產物均一性不佳。第一百零一頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT細胞工程BsAb 將兩種分泌不同特異性單抗的

47、雜交瘤細胞進行再次融合，產生四源雜交瘤 (quadroma)。但二次雜交瘤細胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機組合(zh)物。BsAb在其中的比例可為10%50%不等。多倍雜交瘤細胞的穩定性差，BsAb的產量少且活性低，費時費力，臨床應用時存在人抗鼠抗體免疫反應 (HAMA)，因此不適用于臨床。第一百零二頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT基因工程(jyn gngchng)BsAb 多采用抗體分子片段,如Fab，Fv或 ScFv,經基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接(zhji)表達分泌型的BsAb。第一百零三頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞I

48、g-HGPRT微型雙特異性抗體微型雙特異性抗體diabodydiabody 它是將同一抗體的VH和VL區分布在不同的肽鏈上，構成兩種交聯的ScFv，即 VLA-Linker-VHB和VLB-Linker-VHA。每條獨立(dl)的ScFv鏈均不具備結合抗原的活性，而它們從大腸桿菌共分泌后形成的異二聚體，則可同時識別并結合兩種特異性抗原。由于它具有這種雙特異性，因此在應用上有更大的優越性。第一百零四頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT5、抗體融合蛋白、抗體融合蛋白 一類是將Fv段與其他生物活性蛋白如毒素、酶等結合，利用抗體的特異性識別功能將某些生物活性物質引導到特定(

49、tdng)部位。 另一類是含Fc段的抗體融合蛋白，它是利用Fc段所特有的生物學功能與某些有黏附或結合功能的蛋白融合而成。 第一百零五頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT6、噬菌體抗體、噬菌體抗體 利用基因工程的方法將全套人抗體重鏈和輕鏈V區基因克隆出來，通過噬菌體表面呈現技術(jsh)，將抗體分子Fab段或scFv段表達在噬菌體膜表面，經篩選后獲得特異性抗體，即噬菌體抗體。這種技術稱為噬菌體抗體庫(phage antibody library)技術。所構建的抗體庫稱為全套抗體庫(repertoire antibody)或組合抗體庫(combinatorial ant

50、ibody library)。第一百零六頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT 基本原理基本原理 該技術以噬菌體為載體，將抗體基因(Fab或scFv基因等)與噬菌體編碼(bin m)的外殼蛋白(CP)或（CP）相連，在噬菌體表面以抗體外殼蛋白融合蛋白的形式表達，經輔助病毒感染后，借助CP的信號肽穿膜作用，進入宿主外周基質，在正確折疊后被包裝于噬菌體尾部，隨著攜帶有表達載體的宿主菌就會釋放出帶有抗體的噬菌體。這種噬菌體抗體可以特異識別抗原，又能感染宿主進行再擴增。因此可以采用類似于親和層析原理從噬菌體抗體庫中篩選出特異性抗體。第一百零七頁，共一百二十三頁。HGPRT-T

51、K-雜交瘤細胞Ig-HGPRT構建(u jin)噬菌體抗體庫n從外周血或脾、淋巴結等組織中分離B淋巴細胞，提取mRNA并逆轉錄為cDNA；n應用抗體輕鏈和重鏈引物，根據建庫的需要通過PCR技術擴增不同的Ig基因片段；n構建噬菌體載體。噬菌體抗體庫載體有噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構建表面表達的噬菌體抗體庫(surface display antibody library)常用載體；n表達載體轉化(zhunhu)細菌，構建全套抗體庫。通過多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。第一百零八頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT基本

52、原理 :第一百零九頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT主要特點主要特點：n基因型和表型相統一(tngy)n選擇能力和再擴增能力相結合融合蛋白PIII基因型表達型第一百一十頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT第一百一十一頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT優點1.模擬天然全套抗體庫n抗體文庫可以達到或超過1011庫容,能包含B細胞全部克隆n建庫的外源基因來自人體多克隆細胞的總mRNAn通用引物具有人的種屬普遍性n抗體的VH和VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性方法簡單易行，節省時間。可通過發酵生產、大量制備(zhbi)。2.避開了人工免疫和雜交瘤技術n抗體庫的大容量n抗體庫極高的篩選效率3. 可獲得高親和力的人源化抗體nVH和VL基因的隨機重組模擬了體內抗體親和力成熟的過程n所用的抗體基因又來自人體第一百一十二頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT 四、抗體(kngt)的應用第一百一十三頁，共一百二十三頁。HGPRT-TK-雜交瘤細胞Ig-HGPRT（一）研究(ynji)工具1.探針 單抗只與抗原分子上某一個決定簇相結合，作為探針可從分子、細胞和器官的不同水平上研究各種抗原物質的結構與功能的關系。2.純化蛋白質 抗體是親和層析中重要的配體。將抗體吸附在一