1、分子生物學實驗技術目錄實驗一細菌的培養2實驗二質粒DNA的提取3實驗三紫外吸收法測定核酸濃度與純度4實驗四水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA5實驗五質粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定7實驗六植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析8實驗七聚合酶鏈反應（PCR）技術體外擴增DNA9實驗八 RNA提取與純化11實驗九 RT-PCR擴增目的基因cDNA13實驗十質粒載體和外源DNA的連接反應15實驗十一感受態細胞的制備及轉化16實驗十二克隆的篩選和快速鑒定18實驗十三 DNA分析Southern雜交19一 基本操作實驗一、細菌培養實驗二、質粒DNA提取實驗三、紫外吸收法測定核酸濃度與純度實驗四、水平式瓊脂

2、糖凝膠電泳法檢測DNA實驗五、質粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定實驗六、植物基因組DNA提取、定量、酶切及電泳分析實驗八、植物RNA提取及純化二、目的基因獲取實驗七、聚合酶鏈 式反應（PCR）技術體外擴增DNA實驗九、RT-PCR擴增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表達實驗十、質粒載體和外源DNA的連接反應實驗十一、感受態細胞的制備及轉化實驗十二、克隆的篩選和快速鑒定實驗十三、DNA分析Southern雜交實驗一細菌的培養一、目的學習細菌的培養方法及培養基的配置。二、原理在基因工程實驗和分子生物學實驗中，細菌是不可缺少的實驗材料。質粒的保存、增殖和轉化；基因文庫的建立等都離不開細

3、菌。特別是常用的大腸桿菌。大腸桿菌是含有長約3000kb的環狀染色體的棒狀細胞。它能在僅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的無機鹽的培養基上快速生長。當大腸桿菌在培養基中培養時，其開始裂殖前，先進入一個滯后期。然后進入對數生長期，以2030min復制一代的速度增殖。最后，當培養基中的營養成分和氧耗盡或當培養基中廢物的含量達到抑制細菌的快速生長的濃度時，菌體密度就達到一個比較恒定的值，這一時期叫做細菌生長的飽和期。此時菌體密度可達到1×1092×109/mL。培養基可以是固體的培養基，也可以是液體培養基。實驗室中最常用的是LB培養基。三、實驗材料、試劑與主要儀器（一） 實驗材

4、料大腸桿菌（二） 試劑1、胰蛋白胨2、酵母提取物3、氯化鈉4、1mol/L NaOH5、瓊脂粉6、抗生素（氨芐青霉素、卡那霉素等）（三）儀器1、培養皿2、帶帽試管3、涂布器4、滅菌鍋5、無菌操作臺（含酒精燈、接種環、滅菌牙簽等）6、恒溫搖床四、操作步驟（一）LB培養基的配制配制每升培養基，應在950ml去離子水中加入：細菌培養用胰蛋白胨 10g細菌培養用酵母提取物 5gNaCl 10g搖動容器直至溶質完全溶解，用1mol/L NaOH調節pH位至7.0。加入去離子水至總體積為1L，在15 lbfin2 (1.034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min，即為LB液體培養基。LB固體培

5、養基是在其液體培養基的基礎上另加瓊脂粉15g/L。（二）細菌的培養（）在液體培養基中培養1、過夜培養取5ml液體培養基加入一只無菌的試管中。用接種環或滅菌牙簽挑一個單菌落，接種于培養液中。蓋好試管，在搖床上以60r/min速度，于37過夜培養。、大體積培養按1：100的比例將過夜培養物加入到一無菌燒瓶中，燒瓶的體積應該是培養液體積的5倍以上。于37，約300r/min劇烈搖動培養。（）在固體培養基中培養 細菌在固體培養基上培養主要是為了獲得單菌落和短期保存。平板劃線法分離單菌落采用無菌技術，用接種環將接種物從平板的一側開始劃線。重新消毒接種環，從第一劃線處將樣品劃線至平板的其余部分，重復劃線直

6、至覆蓋整個平板。于37培養直至長出單菌落。實驗二 質粒DNA的提取目的學習堿裂解法提取質粒的原理原理質粒（plasmid）是一種染色體外的穩定遺傳因子，具有雙鏈閉環結構的DNA分子。它具有自主復制能力，能使子代細胞保持它們恒定的拷貝數，可表達它攜帶的遺傳信息。目前，質粒已廣泛用作基因工程中目的基因的運載工具載體。質粒DNA的提取是依據質粒DNA分子較染色體DNA分子小，且具有超螺旋共價閉合環狀的特點，從而將質粒DNA與大腸桿菌染色體DNA分離。現在常用的方法有：堿裂解法、密度梯度離心法、煮沸裂解法等。實驗室普遍采用的堿裂解法具有操作簡便、快速、得率高的優點。其主要原理：利用染色體DNA與質粒D

7、NA的變性與復性的差異而達到分離的目的。在堿變性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋解開而變性，質粒DNA氫鍵也大部分斷裂，雙螺旋也有部分解開，但共價閉合環狀結構的兩條互補鏈不會完全分離，當pH=4.8的乙酸鈉將其pH調到中性時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型，而染色體DNA不能復性，形成纏繞的致密網狀結構，離心后，由于浮力密度不同，染色體DNA與大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。試劑與器材一、 試劑1、LB液體培養基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸餾水中，用NaOH調pH至7.5。高壓滅菌20min。2、LB平板培養基：在

8、每1000mL LB液體培養基中中加入15g瓊脂，高壓滅菌20min。3、溶液：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。4、溶液：0.2mol/L NaOH，1% SDS。（必須現配）5、溶液：pH4.8的醋酸鉀溶液（5mo1/L乙酸鉀 60 mL，冰乙酸11.5 mL，水 28.5mL）。6、TE緩沖液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl，1mmol/ L EDTA。7、無水乙醇和70%乙醇。二、 器材1、 Eppendorf管、離心管架2、 10，100，1000ul微量加樣器3、 臺式高速離心機4、 搖床、

9、高壓滅菌鍋5、 大腸桿菌DH5（含質粒）操作步驟一、 培養細菌將帶有質粒的大腸桿菌接種于LB平板培養基上，37×24h，然后從平板上挑取單菌落，接種于5mL液體培養基中，37×12h。二、 提取步驟1、將菌液移入1.5ml 離心管，8 000rpm×1min，倒置于濾紙上，徹底除去殘液。2、加入100 ul預冷的溶液，用渦旋震蕩器充分懸浮菌體。3、加入4 ul RNase ，室溫×2 min。4、加入200 ul溶液，快速顛倒，溫和混勻，冰浴5min。此時溶液應非常粘稠。5、加入150 ul預冷的溶液，溫和混勻（此時應有可見沉淀），冰浴5 min。6、1

10、2 000rpm×5min。轉移上清液至另一1.5ml離心管中。7、上清液加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，-20×20min。8、12 000rpm×5min，徹底除去殘液。9、加入500ul 70% 乙醇洗DNA沉淀。3 000rpm×1min，徹底揮發除去乙醇。10、加入40ul ddH2O溶解DNA，待用。（或用TE溶解，-20保存）。實驗三 紫外吸收法測定核酸濃度與純度一、目的學習測定DNA或RNA的濃度與純度。二、原理核酸分子中的堿基集團含有共軛雙鍵，它們對紫外光有強烈的吸收。核酸的最大吸收波長在260 nm，吸收低峰在230 nm。可以利用

11、核酸的這一特性對其濃度進行測定。在波長260 nm下，A260=1時，雙鏈DNA的含量為50 µg/ml，單鏈DNA為 33 µg/ml ，RNA為 40 µg/ml，寡聚核苷酸為 2030 µg/ml。測出核酸溶液在A260的值，即可得出濃度。根據經驗數據，純得DNA A260/A280=1.8,純的 RNA A260/A280=2.0.若樣品中含有蛋白或其它雜質會使其比值下降。三、試劑與儀器（一）試劑 TE緩沖溶液（二）儀器 紫外分光光度計四、操作步驟1、 開機，選擇波長開機前應先檢查光路中有無障礙物。然后開啟電源開關預熱20左右。并調節波長在260

12、 nm下。2、選擇A檔，調零面表上有4個可供選擇的模式，本實驗選擇測定A值，因此選擇A模式。待測核酸為水或TE溶液，選擇水或TE做空白對照進行調零。3、測定樣品將待測樣品做適當稀釋，用儀器配套的石英比色杯，以水或TE為對照的條件下測定，讀取并記錄樣品A260的值。4、 計算樣品的濃度雙鏈DNA濃度=50µg/ml×A260×稀釋倍數單鏈DNA濃度=33µg/ml×A260×稀釋倍數單鏈RAN濃度=40µg/ml×A260×稀釋倍數核酸總量=樣品濃度×樣品體積（ml）實驗四 水平式瓊脂糖凝膠電泳法

13、檢測DNA目的學習水平式瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的純度，DNA的構型，含量以及分子量的大小。原理水平式瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中最常規的實驗方法，它簡單易行，只需少量的DNA就能檢測，其分辨效果比分光光度計法與溴化乙啶-標準濃度DNA比較法更高，更直接，檢測DNA范圍更廣，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能發射熒光，當DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡合物；使得DAN發射的熒光，增強幾十倍。而熒光的強度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標準樣品做瓊脂糖凝膠電泳的對照，就可比較出待測樣品的濃度。若用薄層分析掃描儀檢測，則可精確地測得樣品的濃度。電泳

14、后的瓊脂糖凝膠塊直接在紫外光下照射拍照，只需510ng DNA ，就可以從照片上比較鑒別。如肉眼觀察，可檢測到0.010.1ng的DNA。在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與分子量的對數值成反比。質粒DNA樣品用單一切點的酶酶切后與已知分子量大小的標準DNA片段進行電泳對照，觀察其遷移距離，就可以該樣品的分子量大小。凝膠電泳不僅可分離不同分子量的DNA，也可鑒別分子量相同，但構型不同的DNA分子。在抽提質粒的過程中，由于各種因素的影響，使得超螺旋共價閉環結構的DNA（SC）的一條鏈斷裂，變成開環（OS）分子，如果兩條鏈發生斷裂，就變成線形分子（L）分子。這三種構型的分子有不同的遷移率。在一般情

15、況下，超螺旋遷移速度最快，其次為線形分子，最慢的為開環分子。當提取到的質粒DNA樣品中還有染色體DNA或RNA，在瓊脂糖電泳上也可以分別觀察到電泳區帶，由此可以分析樣品的純度。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應，前者由分子所帶凈電荷的多少而定，后者則主要與分子大小及構型有關。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電荷。在電場中向著正極移動，在用電泳法檢測DNA分子時，應當盡量減少電荷效應。增加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應，使得分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度差異所決定，提高分辨率。同時適當降低電泳時的電壓，也可以使分子篩效應相應增強而提高分辨率。試劑與器材一、

16、 試劑1、 DNA樣品2、 TBE緩沖液（5×）：用時需稀釋10倍3、 點樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍，40%甘油4、 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶 注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。5、 瓊脂糖二、 器材1、 電泳儀系統2、 紫外燈3、 恒溫水浴箱操作步驟1 選擇合適的水平式電泳儀，調節電泳槽平面至水平，檢測穩壓電源與正負極的線路。2 選擇孔徑大小適宜的點樣梳，垂直架在電泳槽負極的一端，使得點樣梳的底部與電泳槽水平面的距離為0.51.0mm。3 制備瓊脂糖凝膠：按照被分離的DAN分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。一

17、般情況下可參考下表：瓊脂糖的含量（%）g/ml分離線狀DNA分子的有限范圍(kb)0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，一般配制約40ml 凝膠液，置微波爐中或水浴加熱，至瓊脂糖融化均勻。4 將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，在一端插好梳子。待凝膠溶液冷卻至60左右時，在凝膠溶液中加EB（EB最終濃度為0.5µg/ml），搖勻，輕輕倒入電泳槽水平板上，除掉氣泡。待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽（槽中已加入TBE緩沖液），然后小心地拔掉梳子保持點樣孔完整。注意：電極緩沖液要高出凝膠

18、面2-5。5 待測的DNA樣品中，加入1/5體積的點樣緩沖液，混勻后小心的進行點樣，記錄樣品點樣順序和點樣量。6 開啟電源開關，最高電壓不超過5V/cm。7 電泳時間看實驗的具體要求而異，在電泳中途可用紫外燈直接觀察，DNA各條區帶分開后電泳結束。一般20min3 h，取電泳凝膠塊直接拍照。實驗五質粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定原理限制性內切酶可以識別雙鏈DNA特定位點，并產生特異的切割，形成粘性末端或平末端，這樣有利于DNA片段再連接。限制性內切酶對環狀質粒DNA有多少切點，酶切后就能產生多少個片段。因此，鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區帶數，就可以推斷切點的數目；從片段遷移率的大小可以判斷

19、酶切片段大小的差別。用已知相對分子量DNA為對照，通過電泳遷移率的比較，可以粗略地測出分子形狀相同的未知DNA的相對分子質量。質粒DNA在細胞內有三種構象：共價閉環DNA，常以超螺旋形式存在；如果兩條鏈中有一條鏈發生一處或多處斷裂，分子就能旋轉而消除鏈的張力，形成開環DNA；線狀DNA，雙鏈DNA斷開成線狀。電泳時，三種構象中，共價閉環DNA遷移率最大，其次是線狀DNA和開環DNA。因此在本實驗中，質粒在電泳中呈現23條區帶。試劑與器材一、試劑1、EcoR酶2、DNA3、TBE緩沖液（5×）：用時需稀釋10倍4、 點樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%

20、溴酚藍，40%甘油5、 溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml溴乙啶 注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。6、 瓊脂糖二、器材1、電泳儀系統2、紫外燈3、恒溫水浴箱操作步驟一、 質粒DNA酶切管號質粒DNA101010EcoR/ ul11酶切Buffer（10×）/ ul222ddH2O/ ul876RNA酶11、 按下表將各種試劑分別加入每個Eppendorf管中，要注意管號。2、 加樣后混勻，置于37水浴中，保溫2 h。然后每個管中迅速加入2 ul EDTA終止反應。二、 瓊脂糖凝膠電泳1、 瓊脂糖凝膠的制備（1）稱0.4g瓊脂糖加40ml 0.5 X TBE緩沖液,加熱熔解。冷

21、卻至60加2ul EB，混勻。2、 膠板制備將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，然后倒入熔好的瓊脂糖，并在一端插好梳子。待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽，垂直拔掉梳子。注意：電極緩沖液要高出凝膠面2-5。3、 加樣每個樣品中加入1/10體積Loading buffer（10×），混勻后小心地加入樣品槽中，要避免相互污染。4、 電泳觀察接通電源，電壓為80V×1h左右，當溴酚藍到達下沿1-2處時，停止電泳。5、 觀察及照相將膠板拿出，用自來水小心地沖洗一下。在紫外燈下觀察結果，如果有條件也可用凝膠成像系統照相。實驗六 植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析目的掌

22、握植物基因組DNA提取的一般方法及注意事項。大分子量DNA分子的酶切分析。原理十六烷基三乙基溴化胺（CTAB）是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的,當降低溶液鹽濃度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)時,從溶液中沉淀,通過離心就可將CTAB與核酸的復合物同蛋白質、多糖類物質分開，然后將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。試劑與器材一、 試劑1 、DNA extraction ：500ml31.885g sorbitol (山梨醇)6.05g tris PH8.2 (一般不調)2

23、、Nuclei lysis buffer: 500ml100ml 1M Tris PH7.5100ml 0.25M EDTA200ml 5M NaCl10g CTAB100ml ddH203、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基鈉鹽) 500ml用時，將上述三種溶液按1：1：0.4 比例混勻，加入亞硫酸氫鈉（3.8g/l）,65預熱，既為抽提液。二、 器材操作步驟一、基因組DNA提取1、取0.15g左右小麥葉片，在液氮中迅速研磨后放入1.5ml離心管中，加入700ul抽體液（65預熱）混勻，65水浴裂解40-60 min，期間溫和混勻幾次，加4 ul RNase 室溫靜置2min。2裂解

24、好的DNA ，加入500ul 氯仿：異戊醇（24：1），緩慢混勻，4×11000rpm×10min。3、取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍預冷異丙醇，緩慢混勻后再猛烈混勻，使DNA成團，-20靜置30 min。4、將析出的DNA 離心，4×11 000rpm×10 min。5、去掉上清，將沉淀用500ul 70% 乙醇清洗一次，6、3000 rpm×1 min,徹底揮發除去乙醇，溶于40ul ddH2O。二、酶切及電泳分析管號基因組DNA/g11植物基因組DNA10101010EcoR/ ul1222EcoRBuffer（10&

25、#215;）2555Hind III / ul1222Hind IIIBuffer（10×）2555ddH2O/ ul2626131365RNA酶137反應4h，迅速加入2 ul EDTA 中止反應。0.8%瓊脂糖凝膠電泳（樣品全部點樣）。實驗七 聚合酶鏈反應（PCR）技術體外擴增DNA目的1、學習PCR反應的基本原理和實驗技術。2、了解引物設計的一般要求。原理聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是體外酶促合成DNA片段的一種技術。利用PCR技術可在數小時之內大量擴增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。PCR進行的基本條件：DNA模板（在R

26、T-PCR中模板是RNA）；引物；dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）Taq DNA聚合酶PCR循環由三個步驟組成：變性 使模板DNA解離成單鏈；退火 使引物與模板DNA所需擴增序列結合；延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成與模板堿基序列互補的DNA鏈。每一個循環的產物可作為下一個循環的模板，通過30個左右循環后，目的片段的擴增可達106倍。引物設計：要保證PCR反應能準確，特異，有效的對引物DNA進行擴增，通常引物設計要遵循以下原則：引物長度：1525個核苷酸；CG含量為40%60%；Tm值為55（Tm=4（C+G）+2（A+T）計算；引物與非特異配對位點的配對率小于70%；引物

27、自身配對形成的莖環結構，莖的堿基對小于3，兩條引物間配對堿基數小于5個。由于影響引物的設計的因素比較多，所以常常利用計算機來輔助設計。本實驗以實驗一中提取的質粒DNA為模板，進行PCR擴增，大量得到目的DNA片段。試劑與器材一、 試劑1、 Taq DNA聚合酶2、 10×反應緩沖液（含25mmol MgCl2）3、 dNTP4、 引物（P1、P2）5、 溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。6、 點樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍，40%甘油。二、 器材1、 PCR擴增儀2、 電泳儀3、 臺式離心

28、機4、 紫外分析儀5、 恒溫水浴6、 凝膠成像系統操作步驟一、 PCR擴增1、按下表加入試劑，并小心混勻。模板為實驗一中提取的質粒DNA。試劑體積（ 50ul）ddH2O35ul10 x buffer5ul10×dNTP5ulPrimer P11ulPrimer P21ul模板2ulTaq 酶（2.5U） 1.0ul2、設置PCR程序：94 180s 94 45s 35 cycles: 55 45s72 60s 72 600s3、運行PCR程序二、 PCR產物鑒定反應結束后，取20ul PCR產物進行1.2%瓊脂糖電泳分析。實驗八 RNA提取與純化一、目的掌握RNA提取的基本技術，了

29、解RNA提取過程中的各種注意事項。二、原理RNA提取是分子生物學實驗中難度較大的實驗技術。RNA提取和DNA提取有類似的地方，因為它們都是核酸，都具有較好的水溶性。提取RNA首先破碎細胞，然后用提取液將RNA溶出，反復抽提去除蛋白質，加入乙醇沉淀RNA，將RNA沉淀溶解備用。那么如何區分DNA和RNA分開？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的鹽溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的鹽溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它們的溶解性將它們進行區分。另外，RNA的分子量一般比較小，而DNA分子很大且和蛋白結合成復合體，所以DNA更容易隨蛋白沉淀，而RNA具有較好的溶解性。RNA提取的

30、另一個關鍵問題就是如何抑制或去除環境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和鐵器具在180×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1的DEPC水37過夜浸泡，然后濕熱滅菌80烘干備用。配制溶液所需的水也要用DEPC處理過的水，而配置Tris相關的緩沖液時Tris會與DEPC發生反應，應避免用DEPC處理。另外操作過程中應戴手套。判斷RNA 的質量主要有兩個標準，一是純度，二是完整性（是否被降解）。RNA的純度可以通過分光光度計進行測定的A260A280值來判斷。RNA的完整性主要通過電泳分析來闡明，未降解的總RNA電泳時在凝膠中會出現18S和28SrRNA對應的條帶（如果有DNA污染則在RNA后會發

31、現基因組DNA對應的條帶）。RNA電泳系統也要嚴格對RNA酶進行處理。如果用普通瓊脂糖凝膠電泳，則用盡量減少電泳時間。三、試劑與器材（一）試劑1、暗培養7天的小麥苗，用前光照誘導3 h2、DEPC3、DEPC處理的ddH2O4、RNA提取液：（每1000毫升中含有） Tris 6.06 克 (最終濃度為50 mM ) LiCl 6.03 克 (LiCl -H2O 9.06克) (最終濃度為150 mM ) EDTA（0.5 M） 10 毫升 (最終濃度為5 mM ) SDS 50 克 (最終濃度為5 % )5、8 M Li Cl：33.92克Li Cl 溶于100 ml DEPC處理的ddH2

32、O6、 水飽和酚7、 氯仿8、 0.5M NaCl9、 溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。10、點樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍，40%甘油。三、 器材1、 分光光度計2、 電泳儀3、 臺式離心機4、 手提式紫外監測儀5、 恒溫水浴6、 凝膠成像系統四、操作步驟1、取植物葉片1-3克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分裝，小量提取試劑量可減至110)2、液氮揮發完之前，倒入含有10 毫升RNA提取液的離心管中，迅速反復倒置混勻，直至看不見任何團狀物為止。3、立即加入10毫升的等體積（酸性）酚/氯仿

33、，劇烈（！）反復倒置混勻5至10min（如在震蕩器上震蕩，要確保混勻而不能僅僅是振動！）。4、13000g×5min，吸管取上清（注意避免吸取界面上的蛋白）。5、重復步驟3和4，三次左右（注意觀察界面上白色物質）。6、取上清，加入等體積的氯仿，反復倒置混勻2-5min。7、13000g×5min。8、取上清，加入1/3體積8 M 的 LiCl （即8 M LiCl應占最后體積的25%）， 沉淀RNA，4過夜。9、離心13000g× 10 min。10、棄上清,保留沉淀（此時應把RNA沉淀轉入Eppendorf管中，以便于操作）, 加入70%無水乙醇+30% 0.5

34、 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗滌沉淀數分鐘（和緩地反復倒置混勻），離心 （13000g× 2 min）。重復洗滌沉淀數次。11、用70%乙醇再洗滌2次沉淀，去掉鹽離子。12、用槍頭吸去殘留的液體，真空干燥2min。13、加入200ulDEPC 處理過的水溶解RNA。14、取用5ul電泳檢測RNA完整性, 用TEB 緩沖液, 200V×20-30min。15、取5 ul稀釋40倍測定RNA純度和濃度，A260 nm /A280 nm應在 2.0 左右。16、將RNA 分裝,放在-70長期保存備用.輔助方案：試劑盒提取法（Trizol）（一）試劑： 1.Ttizol R

35、eagent 2.氯仿3.異丙醇4.70%無水乙醇5.DEPC（二）器材：1、 研缽2、 離心機（三）實驗步驟1、 稱取小麥葉片50-100mg,于研缽中加液氮研磨成粉末，迅速轉移到1.5ml離心管中。2、 加入1 ml Trizol Reagent，1530×5min。 3、 加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15 sec，1530×3min。4、 冷凍離心12000 rpm×15min。5、 將上清液轉移到另一個離心管中，加0.5ml預冷異丙醇,混勻 ，-20放置20min。6、 冷凍離心12000 rpm×10min。7、 加入0.5ml 70% 乙醇洗

36、RNA沉淀，懸浮，7500rpm×2min，除去乙醇。8、 加入30 ul DEPC 處理過的ddH2O溶解RNA。實驗九 RT-PCR擴增目的基因cDNA目的學習從細胞或組織的RNA中用逆轉錄PCR擴增目的基因的技術及操作。原理普通PCR方法可以以DNA為模板擴增基因，但真核生物的基因組中通常分為可轉為mRNA的外顯子和不轉錄的成mRNA的內含子，所以從染色體DNA用PCR方法擴增出的基因是內含子和外顯子相間排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表達。如果用人工的方法把內含子去除，是極其煩瑣費力的事。逆轉錄PCR利用逆轉錄病毒依賴于RNA的DNA逆轉錄合成酶，在反義引物或olig

37、o（d T）的引導下合成mRNA互補的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用兩條引物以cDNA為模板，擴增出不含內含子的可編碼完整蛋白的基因。這一DNA的5，和3，端經改造可直接用于基因工程的表達，因此逆轉錄PCR成為了目前獲取目的基因的一條重要途徑。試劑與器材一、 試劑1、 RNA模板2、 cDNA引物3、 反轉錄緩沖液4、 dNTP5、 AMV反轉錄酶6、 RNA抑制劑（RNasin）7、 Taq酶8、 10×PCR緩沖溶液9、 引物（P1、P2）二、器材1、PCR擴增儀2、電泳儀3、臺式離心機4、恒溫水浴5、紫外分析儀6、微量移液器操作步驟一、RN

38、A的反轉錄1、在小管中依次加入5 ul RNA 6 ul DEPC H2O 混合后,65×5 min(破壞二級結構). 2、 置于冰浴5 min.3、在管中依次加入: (反應體系為20 ul) RT buffer ( 5×) 4 ul RNasin 0.5 ul dNTP ( 10mM) 2 ulOligo T17A（GC） （50-100 uM） 1 ulAMV反轉錄酶1 ul 置于 42× 1 h。4、70× 5 min（使酶失活，可省略）。5、加入100ul ddH2O(從總RNA開始制備)或1000 ulddH2O（從mRNA開始制備）。6、置于

39、-20保存備用.二、 PCR擴增DNA在滅菌的0.5ml PCR管中，依次加入20l cDNA10l 10×PCR buffer5l dNTP2lRT引物I2l RT引物II1l Taq DNA聚合酶加ddH2O 補足50l ，混勻。PCR程序：94 3 min 9530s 35 cycles: 55 60s72 90s 72 10 min三、PCR產物的鑒定取20ul PCR產物進行1.2%瓊脂糖電泳分析。實驗十 質粒載體和外源DNA的連接反應一、目的掌握DNA體外連接的基本技能，了解連接反應的注意事項。二、原理DNA片段之間的連接是通過DNA連接酶的催化實現的。DNA連接酶催化具

40、有平末端或互補粘性末端的DNA片段間相鄰堿基通過3,5磷酸二酯鍵連接起來，該反為需能反應，通常需要加入ATP或NADH，DNA連接酶對粘性末端的連接效率要遠高于對平末端的連接效率。在基因基因工程實驗中，最常用的來源于T4噬菌體的T4DNA連接酶。對于平末端或互補的粘性末端可直接進行連接反應。一個片段是平末端，另一片段為粘性末端或兩個片段都是粘性末端但不配對，則需要通過各種方式使其可一匹配或通過平末端進行連接。通常采用末端補平、加同聚物尾、加接頭等方式是目的片段之間能夠匹配。進行連接反應時，為了減少片段的自連，通常要進行去磷酸化，去磷酸化可通過堿性磷酸酶完成。比如將目的片段和載體進行時通常要將載

41、體去磷酸化，以減少載體的自連。同要進行連接反應也經常對目的片段進行磷酸化以增強目的片段的連接，在相鄰堿基間如果沒有磷酸在連接效率大幅下將，如果載體進行了去磷酸化，目的片段可進行磷酸化，以增強目的片段和載體的連接。在連接反應中，目的DNA片段和載體的比例是一個關鍵問題，對于長度為1kb的片段和3kb的載體而言，通常目的片段和載體的比例設為2：1或3：1，如果目的片段越長該比例應再升高，因為主要考慮的是載體和目的片段之間的分子數的比例。反應體系中核酸的濃度也是一個重要問題，通常反應體系中反應物濃度應保持在25-100 ng / l。連接反應和其它酶不同，需要在較低的溫度下進行，通常在1216過夜，

42、也可在4過夜連接，如果是平末端連接，可適當提高連接溫度。除上述因素外，DNA樣品的純度、鹽濃度等會影響連接效率。三、試劑與器材（一）試劑1、目標DNA片段（實驗九RT-PCR擴增產物）2、載體（pGEMT-easy）3、2 × ligation 緩沖液4、T4 DNA連接酶5、ddH2O（二）器材1、臺式離心機2、恒溫水浴3、微量移液器四、操作步驟1、取一個1.5ml離心管依次加入下列試劑:2 × buffer： 5lpGEMT-easy： 0.5l目的片段： 2.5lT4連接酶： 1lddH2O 1l2、 2000 rpm 離心30S，使反應體系充分混合。3、4過夜連接。

43、實驗十一 感受態細胞的制備及轉化目的掌握感受態細胞制備和轉化的基本方法。原理受體細胞經過一些特殊方法如電擊法, 化學試劑法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的處理后,細胞膜的通透性發生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞。試劑與器材一、 試劑1、0.1mol/L CaCl2取20ul PCR產物進行1.2%瓊脂糖電泳分析。2、LB液體培養基（見實驗一）3、LB固體培養基（見實驗一）4、氨芐青霉素（100mg/mL）二、 器材1、 冷凍離心機2、 平衡天平3、 無菌操作臺4、 微量移液器操作步驟一. 感受態細胞的制備(0.1M CaCl2方法)1、 從LB固體平板挑單克隆于

44、5ml LB液體培養基中(不加抗生素)，37×200rpm×12-16h，可過夜培養。2、 將活化菌體按15接種到LB中，擴大培養37×200rpm×2h，至OD600約為0.4。3、 取培養好的菌液1.5 ml于一離心管中，4 離心8 000rpm×1 min。 4、 棄上清，加500 ul0.1M CaCl2 (滅菌預冷)洗菌體，4冷凍離心8000rpm×1 min。5、 徹底除去殘液, 加200 ul0.1M CaCl2(滅菌預冷)，懸浮菌體。6、 冰浴靜置 30 min ，4冷凍離心8000rpm×1 min。7、

45、棄上清，加100 ul0.1M CaCl2 (滅菌預冷)，懸浮菌體，即為制備好的感受態細胞。附注：、 整個過程注意無菌操作和保持低溫。、 培養物處于對數生長期是制備感受態細胞的關鍵。、 如果要求高轉化效率，不建議使用簡單深凍保存的感受態細胞。、 LB液體培養基建議用不加抗生素和加抗生素的兩種培養基，檢查菌體是否污染。、 D600值指細胞密度，用于判斷培養物是否處于對數生長期。OD600值在0.4 - 0.5時，此時培養物處于對數生長期，細胞數在20min內加倍。二、質粒對大腸桿菌的轉化1、將連接產物加入100 ul制備好的感受態細胞，冰上放置30min。2、42熱激90S。3、迅速冰浴3min

46、。4、加入300 ul LB液體培養基，37輕搖培養45min。5、加入30 ul X-gal和6 ul IPTG,混勻。6、取100 ul涂布在含有50 ug/ml氨芐的LB固體培養基中。7、37倒置，避光培養16-20h。8、藍白斑篩選，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定。實驗十二克隆的篩選和快速鑒定目的掌握快速細胞破碎法測定大小不等的眾多的質粒DNA；和菌落PCR快速鑒定克隆。原理在這個實驗方法中，只需配制一種細胞緩沖液（它可以在室溫下保存，長期使用）。利用破碎細胞緩沖液中的陰離子去污劑-SDS在37溶解膜蛋白，使細胞破裂，并解聚核蛋白，SDS還能與蛋白質結合形成復合物，使得蛋白質沉淀。利用E

47、DTA螯合金屬離子，防止破碎細胞的脫氧核糖核酸酶對DNA的降解。然后高速離心，去除細胞碎片核大部分的染色體DNA和RNA蛋白，將含有質粒DNA的上清夜直接進行點樣電泳和分離。在瓊脂糖凝膠上分離開的個組分中，有染色體DNA，不同大小的質粒DNA和RNA，它們都可以經肉眼觀察或拍照顯示。或者用設計好的引物，做菌落PCR快速鑒定克隆。試劑與器材一、 試劑1、 破碎細胞緩沖液50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)1% SDS2mmol/L EDTA400mmol/L蔗糖0.01%溴酚藍配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10毫升 20% SDS 10毫升 250mmo

48、l/L EDTA 1.6毫升 蔗糖 27.2克 1.2%溴酚藍 1.67毫升 加ddH2O至200毫升2、 10mg/ml 溴乙啶3、 TBE電泳緩沖液（5×）4、 Taq DNA聚合酶5、 10×反應緩沖液（含25mmol MgCl2）6、 dNTP7、 點樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍，40%甘油。二、 器材1、 電泳儀2、 1.5ml 離心管3、 Tip 4、 培養皿5、PCR擴增儀7、 臺式離心機8、 紫外分析儀9、 恒溫水浴操作步驟一、快速細胞破碎法測定1、 取1.5ml離心管編號碼，每管加入50ul破碎細胞緩沖液。2、

49、 取一培養皿在底部標記如圖所示1 2 34 5 67 8 910 11 123、 待轉化的細菌菌落長到2mm時4、 用牙簽挑取單克隆將菌落點在作好標記的方格內，然后將牙簽加入對應的培養管中（培養管中含5ml LB液體培養基）。5、 培養皿37×6 h后4保存。培養管37×12 h左右。6、 用培養管中的菌液提取質粒。7、 酶切電泳檢查質粒。二、菌落PCR快速鑒定法1、直接用牙簽或接種針挑取少許菌體加入25ul或50ul PCR反應體系中。2、用通用引物或特異引物進行PCR，根據擴增條帶的有無和大小來判斷插入片段的有無、大小及方向（反應體系參照前面實驗）。試劑體積（ 50ul

50、）ddH2O37ul10 x buffer5ul10×dNTP5ulPrimer P11ulPrimer P21ul模板1個菌落Taq 酶1ul實驗十三 DNA分析Southern雜交目的學習Southern雜交的原理及操作方法。原理（一）所謂DNA探針，實際上是一段已知序列的基因片段，應用這一基因片段即可與待測樣品雜交。如果靶基因和探針的核苷酸序列互補，就可按堿基配對原則進行核酸分子雜交，從而達到檢測樣品基因的目的。在隨機引物法標記的反應液中，有隨機合成的六聚核苷酸作為引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作為合成底物，以單鏈DNA作為模板，在Klen

51、ow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA鏈。以地高辛標記的探針與靶基因DNA鏈雜交后，再通過免疫反應進行檢測。通過酶標記地高辛抗體檢測，可以肯定雜交反應存在。免疫檢驗一般用堿性磷酸酶系統，BClP/NBT顯色。敏感性很高。可用于膜上雜交和原位雜交。（二）核酸探針膜上雜交原理1、雜交總原則脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵縮合成長鏈構成DNA一級結構。兩條堿基互補的多核苷酸鏈按堿基配對原則形成雙螺旋，構成DNA的二級結構。某些條件（如酸堿,有機溶劑，加熱）可使輕鍵斷裂，DNA雙鏈打開成單鏈重新結合。所謂雜交，是具有一定互補序列的核酸單鏈，DNA單鏈仍然可與序列同源的單鏈按堿基互補的原則結合成異源性雙鏈的過程

52、。2、雜交膜的選擇雜交膜可以選擇硝酸纖維素和尼龍膜。硝酸纖維素膜的優點在于本底較低，但只能用于顯色性檢測，且不能用于重復雜交。尼龍膜分為帶正電的膜和不帶電的膜兩種。帶正電的膜對核酸結合力強，敏感性也高。不帶電的結合力低。敏感性差。尼龍膜的優點在于雜交用過的膜，用洗脫液（0.1xSSC,0.1%SDS）煮沸5-10min后去探針，可用于新的探針雜交。如果對雜交結果不滿意，如背景太高或顯色不強，也可洗去探針之后重新雜交。3、預雜交和雜交液預雜交和雜交都使用相同緩沖液，不同的僅是預雜交液中不含探針。下面是幾種基本的雜交液配方：（1）Standard buffer: 5Xssc,0.1%(w/v) N

53、-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1%Blocking Reagent.（2）Standard buffer+50% formamide:50% formamide(deionized),5Xssc,0.1%(W/V)N-lauroylsarcosine.0.02% (w/v)SDS,2%Blocking Reagent.（3）High SDS buffer(church buffer): 7%SDS,50% formamide(deionized),5Xssc, 2% Blocking Reagent,50MmSodium phosphate,0.1% N-La

54、uroylsarcosine.4、Southern BlottingDNA片段經電泳分離后按分子量大小排列在瓊脂糖凝膠上。1975年Southern發明了利用濃鹽溶液的推動作用將變性的單鏈DNA轉移到硝酸纖維素膜上的方法，解決了原位轉移的問題。雖然其原理和操縱均很簡單，卻是基因分析中必不可少的手段，已經得到了廣泛的應用。Southern印跡雜交包括兩個步驟：（1）把電泳分級的DNA轉移到固定支持膜上。(2) 與標記的DNA探針雜交。操作步驟一、探針的標記1、用滅菌去離子蒸餾水稀釋1gDNA至總體積16l.。2、DNA熱變性：把DNA置于沸水中水浴10min。然后迅速插入碎冰中3min以上。3、加4l DIG Random Labeling Mix(高效)，混勻后再離心2000rmp×5min。4、置于37反應至少2 h 。時間越長,標記探針的產量越高。延長反應時間至20 h可明