1、實驗四 堿性蛋白酶活力的測定（賴凌峰 李佳佳 鄧仕彬）一、原理以酪蛋白為底物測定堿性蛋白酶的活力。酪蛋白經蛋白酶作用后，會降解成相對分子質量較小的肽和氨基酸，在反應混合物中加入三氯醋酸溶液，相對分子質量較大的蛋白質和肽就沉淀下來，相對分子質量較小的肽和氨基酸仍留在溶液中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的數量正比于酶的數量和反應時間。因而采用Folin 法測定上清液中肽的含量就可以計算酶的活力。二、試劑1、0.1mol/L 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH10）2、5%三氯醋酸3、1%酪蛋白溶液：稱取5g 酪蛋白置于500mL 0.1mol/L 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH10）中，加熱使其溶解。4、0.

2、4mol/L 碳酸鈉溶液5、100g/mL 酪氨酸溶液6、Folin 試劑，稀釋3 倍使用如果自己配制，可按下法：于2000mL 磨口回流裝置內加入鎢酸鈉（Na2WO4.2H2O）100g，鉬酸鈉（Na2MO2.2H2O）25g，加水700mL，85%磷酸50mL，濃鹽酸100mL，文火回流10 小時。取下回流冷凝器，加入硫酸鋰50g，水50mL 和濃溴水（99%）數滴，再煮沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有綠色需再加溴水），冷卻，加水定容至1000mL，混勻，過濾，制得的試劑應顯金黃色，貯于棕色瓶內。三、步驟1、酶液的萃取稱取1g 粗酶制劑置于研缽中，加少量緩沖液一起研磨，然后定容至10

3、0mL，從容量瓶中取出5mL 酶液（視酶活而定）再定容至100mL，稀釋后的酶液經濾紙過濾后得到澄清的酶液。2、酶活力的測定樣品管：取不同量的酶液（0.2，0.4，0.6mL），用0.1mol/L 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH10）補足體積到1.0mL，然后在每個樣品管中再加入1mL 預先在40保溫的1%酪蛋白溶液，混勻并開始計時，在40準確保溫10min，加入2mL 5%三氯醋酸溶液，迅速搖勻，于室溫靜置半小時。空白管：先在每支試管中各加入1.0mL 1%酪蛋白溶液和2.0mL 5%三氯醋酸溶液，搖勻后，再加入1.0mL的酶液，酶液濃度分別與對應的樣品管相同，在40下準確保溫10min，以下

4、操作同樣品管。將酶反應混合物過濾后收集濾液，在1mL 濾液中加5mL 0.4mol/L 碳酸鈉溶液和1mL Folin 試劑，搖勻后在40恒溫水浴中顯色20 min，以相應的空白管中的反應液為對照，在680nm 下測定樣品管中反應液的吸光度。3、酪氨酸標準曲線為了確定酪氨酸與OD值的對應關系，需事先用不同濃度標準酪氨酸溶液與Folin 試劑反應顯色，測定OD 值標準曲線。（1）不同濃度的標準酪氨酸溶液按下表配制：管號酪氨酸的濃度（g/mL）100g/mL酪氨酸溶液（mL數）蒸餾水（mL數）空白0011100.10.92200.20.83300.30.74400.40.65500.50.5660

5、0.60.4（2）向上表配制的不同濃度的酪氨酸溶液中分別加入0.4mol/L 碳酸鈉溶液5mL，Folin 試劑1mL，置于40恒溫水浴顯色20min，在680nm 下以空白為對照，測定各樣品管溶液的吸光度。（3）以吸光度（OD）為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線，由直線斜率計算K 值。四、數據處理1、根據標準曲線計算K值酪氨酸濃度（g/mL）0102030405060吸光度0.0000.1130.2130.3180.4200.5210.614用Excel擬合得，K=97.33（OD值為1時相當的酪氨酸微克數）。2、酶活力計算酶液加入量（mL）相當于粗酶制劑（g）空白管OD值樣品管OD

6、值酶活力（*104單位數/克酶制劑）平均酶活力（*104單位數/克酶制劑）0.20.00010.0000.29611.529.980.40.00020.0000.5129.970.60.00030.0000.6508.44酶活力單位的定義在上述實驗條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1g 酪氨酸定義為1 個酶活力單位。酶活力的計算：酶活力（單位數/克酶制劑）=4/10×K×OD×n式中 4 反應混合物總體積為4mL10酶反應時間為10minK標準曲線中OD 值為1 時相當的酪氨酸微克數n 酶液的稀釋倍數五、討論1、酶反應的溫度、pH 和時間對被水解的肽鍵數量有直接的影響，因此必須嚴格控制。2、用三氯醋酸終止反應后，過濾反應混合物所得的濾液必須是澄清的。3、因為Folin試劑對酸性環境比較敏感，容易發生變化，因此