1、細胞培養之無菌操作目錄實驗器具和材料的準備培養室的消毒洗手和著裝無菌操作污染及防治 無菌 定義：對一個環境所謂的無菌，是指在環境中一切有生命活動的微生物的營養細胞及其芽胞或孢子都不存在 無菌技術 定義：無菌技術是細胞工程的基本技術包括實驗器具和材料的準備、培養室和超凈臺的消毒、洗手和著裝、無菌操作等 意義：因體外培養細胞沒有抗感染能力，防止污染則是決定培養成功與否的首要條件，即便是在設備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術操作不規范，也會導致污染。為在一切操作中盡可能保證無菌，每一項工作我們都必須做到有條不紊和完全可靠。 消毒滅菌 消毒：是指殺死病原微生物、但不一定能殺死細菌芽孢的方法。通常用

2、化學的方法來達到消毒的作用。用于消毒的化學藥物叫做消毒劑。 滅菌：殺滅或除去特定環境或物品中一切微生物的過程。目前標準規定，滅菌過程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6及以下。消毒劑種類 依據化學成分主要分為9種 醛類消毒劑 雜環類消毒劑 含氯消毒劑 過氧化物類消毒劑 含碘消毒劑 季銨鹽類消毒劑 酚類消毒劑 胍類消毒劑 醇類消毒劑 重金屬類消毒劑 生物類消毒劑消毒 新潔爾滅消毒液 原理：新潔爾滅滅菌原理為破壞細胞膜、改變其滲透性而起殺菌作用 84消毒液 84消毒液是一種以次氯酸鈉為主的高效消毒劑，主要成分是次氯酸鈉，次氯酸鈉的漂白性是其與水反應生成的次氯酸所帶來的，因次氯酸具有極強的

3、氧化性，能夠將大多數物質氧化，使其變性，因而能起到消毒作用消毒 75%酒精消毒原理 酒精之所以能消毒是因為酒精能夠吸收細菌蛋白的水分，使其脫水變性凝固，從而達到殺滅細菌的目的。如果使用高濃度酒精，對細菌蛋白脫水過于迅速，使細菌表面蛋白質首先變性凝固，形成了一層堅固的包膜，酒精反而不能很好地滲入細菌內部，以致影響其殺菌能力。75%的酒精與細菌的滲透壓相近，可以在細菌表面蛋白未變性前逐漸不斷地向菌體內部滲入，使細菌所有蛋白脫水、變性凝固，最終殺死細菌，酒精濃度低于75%時，由于滲透性降低，也會影響殺菌能力。潔凈級別無菌藥品生產所需的潔凈區可分為4個級別 A級：高風險操作區，如灌裝區、放置膠塞桶和與

4、無菌制劑直接接觸的敞口包裝容器的區域及無菌裝配或連接操作的區域，應當用單向流操作臺（罩）維持該區的環境狀態。單向流系統在其工作區域必須均勻送風，風速為0.36-0.54m/s（指導值）。應當有數據證明單向流的狀態并經過驗證。在密閉的隔離操作器或手套箱內，可使用較低的風速。 B級：指無菌配制和灌裝等高風險操作A級潔凈區所處的背景區域。 C級和D級：指無菌藥品生產過程中重要程度較低操作步驟的潔凈區。實驗器具和材料的準備 在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作計劃，有關數據的計算要事先做好。根據實驗要求，準備各種所需耗材物品及試劑，清點無誤后將其放置在操作場所進行消毒處理。 凡是需要帶入安全柜（超凈臺）

5、的培養基、胰酶、培養皿（培養瓶）等耗材和試劑在經過消毒處理之后再用75%的酒精棉球擦拭表面。培養室的消毒 進入無菌實驗室前先穿好無菌服、戴帽子及口罩 無菌實驗室每周用0.2%的新潔爾滅拖洗地面、粘塵桿去除灰塵，再用臭氧消毒 室內臺面要保持潔凈，做完實驗后用75酒精或千分之三新潔爾滅棉球擦拭超凈工作臺的臺內、邊臺的臺面、倒置顯微鏡的載物臺等 實驗所用物品盡可能一次性準備好，避免多次出入洗手和著裝實驗人員進入凈化車間流程：非凈化區域換拖鞋進入更衣室放個人物品洗手烘干戴上帽子消毒雙手進入更衣室穿凈化服穿凈化鞋戴口罩戴手套洗手和著裝洗手和著裝洗手和著裝無菌操作個人防護 在實驗室工作時必須使用個體防護裝

6、備 個人衣服和普通實驗服不能穿入細胞培養室內 實驗室內不能穿長擺裙，短裙及短褲，不得在實驗室內穿露腳趾的鞋子 實驗室內嚴禁處理和配戴眼鏡 嚴禁穿著細胞培養室專用防護服離開實驗室 發生手套破損應立即更換無菌操作超凈臺的消毒 超凈工作臺臺面每次實驗前要用75%酒精擦洗，然后用紫外線消毒30min 在工作臺面消毒時切勿將培養細胞和培養用液同時照射紫外線 消毒時工作臺面上用品不可過多堆放，否則會遮擋射線降低消毒效果 一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內同時紫外線消毒超凈工作臺 超凈臺是做一般對人體沒有直接傷害的常規細菌的操作實驗，正壓送風，工作臺工作區域的氣流形成為

7、水平層流型。區內空氣經初效過濾器過濾后，由風機壓入靜壓箱，再經高效過濾器過濾，由此送出的潔凈氣流，以一定的均勻斷面風速通過操作區將塵埃顆粒帶走，從而形成高潔凈的工作環境。超凈空氣的流速為，這已足夠防止附近空氣可能襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會妨礙采用酒精燈或本生燈對器械等的灼燒消毒生物安全柜 生物安全柜一般是做致病菌，霉菌，酵母菌，病毒來用，操作區域是負壓，簡單說是往上處抽風的，當然致病菌也不是直接抽出排到室外，是過濾在生物安全柜的頂部漏器上，從排風量上可以分為，50%外排型，75% 以及100%外排型。在生物安全柜內所形成的幾乎沒有微生物的環境中，盡量避免使用明火，酒精燈的火焰可能會影響

8、室內的氣流平衡。無菌操作器皿的消毒 所有用到的器皿（買時已滅菌的除外）都必須經過高壓滅菌烘干后才能放入超凈臺內 已滅菌的、外包裝完好的培養瓶、離心管、凍存管等可以表面經75%酒精擦拭后直接放入超凈臺 凡是帶入超凈工作臺內的酒精、PBS、培養基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面無菌操作細胞處理 超凈臺經過30min紫外滅菌后，才能打開通風裝置 開始工作的第一步就是點燃酒精燈，之后的一切操作都需在火焰近處并經過燒灼進行，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸，繼續使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火 進行培養時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污

9、染機會。不能用手觸及已消毒器皿內部，如已接觸，則取備品更換 不同種細胞實驗分次處理，以免交叉污染無菌操作細胞處理 培養瓶打開后，應平放在臺面，瓶口保持斜向上 打開的培養液瓶口也應保持適度傾斜放置，避免瓶口垂直放置 在具體操作過程中，也應注意所有的瓶口保持傾斜，手或相對較臟的物品不能經過開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時如吸管尖碰到瓶口，則應將吸管丟掉 吸取營養液、 PBS、細胞懸液及其它各種用液時，均應分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或導致細胞交叉污染無菌操作物品擺放 為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應是右手使用的東西放置在右側，左手用品在左側，酒精燈置于中央 培養的細

10、胞較多時，打開的培養瓶蓋應按照一定的順序擺放，保證瓶子之間的蓋子不會亂蓋無菌操作培養瓶的拿取 從培養箱內取培養皿或培養瓶之前，先用酒精消毒雙手，再取培養皿或培養瓶 做鏡下觀擦時，保持蓋子是擰緊狀態 操作結束后，培養瓶先擰緊瓶蓋，經75%酒精擦拭后放入培養箱 培養瓶蓋、胰酶瓶等的蓋子只有在要取液時方能打開，取完后立即燒灼旋緊。無菌操作結束后消毒 實驗結束后，規范熄滅酒精燈，用75%酒精棉球擦拭超凈臺內部，操作區域至少擦拭3次 超凈臺外部，操作口處用75%酒精棉球擦拭 消毒結束后，拉下超凈臺玻璃門，打開超凈臺紫外30min 離開培養室時，注意關閉照明燈，打開紫外燈污染及其防治處理 化學污染物（培養

11、基、血清和水中的雜質、內毒素、增塑劑和去污劑） 生物污染物（細菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細胞系的交叉污染）生物污染細菌 細菌：是一大類廣泛存在的單細胞微生物。直徑一般為幾個微米，外形多樣（球狀、桿狀盒螺旋狀）。培養物被細菌污染后，幾天內即可通過簡單的肉眼觀察發現：被感染的培養物通常呈渾濁狀，在低背景下可見移動的微小顆粒，高倍鏡下可分辨各個細菌的形狀。生物污染酵母 酵母是真菌界的一種單細胞真核微生物,大小從數微米到40微米不等。與細菌污染類似。在顯微鏡下，酵母呈單個卵圓形或球形顆粒。有些會芽生出較小的顆粒。生物污染霉菌 霉菌是真菌界的一種真核微生物，已被稱為菌絲的多細胞絲狀體形式生長。

12、一般情況下，霉菌污染是較易發現辨別的。生物污染病毒 病毒是一種微觀感染性物質，利用宿主細胞結構進行復制。病毒體積極小，因此要檢測培養物中有無病毒以及將其從細胞培養實驗室所用試劑中去除都十分困難。通過電子顯微鏡檢查、一組抗體的免疫染色、ELISA實驗或者采用適當病毒引物的PCR技術可以檢測出細胞培養物的病毒污染。生物污染支原體 支原體是一種沒有細胞壁的簡單細菌，被認為是能夠進行自我復制的最小微生物。由于體積極小，支原體的檢測十分困難。唯一切實有效的檢測支原體污染的方法就是采用熒光染色、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或者微生物學測定技術定期檢測培養物。無支原體細胞支原體感染細胞用熒光染料

13、Hoechst33258染色，此染料能與DNA特異結合，可是支原體內DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在細胞周圍或附于細胞表面合生物污染交叉污染 交叉污染雖不如微生物污染普遍，但許多細胞系與HeLa細胞及其他生長迅速的細胞系間廣泛的交叉污染是一個明確的問題會造成嚴重后果。細胞的生長特性、形態會發生變化。無法進行實驗研究。 在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口，以免把細菌帶到培養液中污染其他細胞 細胞一旦購置或從別處引入，均應及早留種凍存，一旦發生污染可重新復蘇培養污染防治 在生產過程中，從器皿的洗滌、生產所需物品的準備到細胞的生產所有的工作人員必須按照GMP和標準操作