1、核酸分子雜交技術核酸分子雜交技術第第 一一 節節 核酸分子雜交的基本原理核酸分子雜交的基本原理原理：堿基互補配對原則原理：堿基互補配對原則 一、核酸分子雜交一、核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補形成異源雙螺旋分子，稱為補形成異源雙螺旋分子，稱為核酸分子雜交核酸分子雜交。 雜交可分成：雜交可分成：DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之間的雜交。之間的雜交。復性復性RNADNAn待測核酸序列待測核酸序列n探針探針(probe)：已知核酸序列已知核酸序列二、二、DNA的變性的變

2、性(denaturation)n定義：定義：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNADNA雙鏈解開雙鏈解開 成兩條單鏈的過程。成兩條單鏈的過程。n方法：方法：過量酸、堿、加熱、變性試劑如尿素、過量酸、堿、加熱、變性試劑如尿素、 甲酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。甲酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。 變性后其它理化性質變化：變性后其它理化性質變化： OD260OD260增高增高粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降浮力密度升高浮力密度升高 酸堿滴定曲線改變酸堿滴定曲線改變生物活性喪失生物活性喪失DNADNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸

3、收值的改變例：變性引起紫外吸收值的改變DNADNA的紫外吸收光譜的紫外吸收光譜增色效應：增色效應：DNADNA變性時其溶液變性時其溶液OD260OD260增高的現象。增高的現象。熱變性熱變性解鏈曲線：解鏈曲線：如果在連續加熱如果在連續加熱DNADNA的過程中以溫的過程中以溫度對度對A260A260值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。目目 錄錄Tm：變性是在一個相當窄的溫度范圍內完成，在這變性是在一個相當窄的溫度范圍內完成，在這一范圍內，雙鏈一范圍內，雙鏈DNADNA變性一半所需要的溫度稱為變性一半所需要的溫度稱為DNADNA的的解鏈溫度，又稱熔解溫度解鏈溫度，又稱熔解

4、溫度(melting temperature, Tm)。其大小與其大小與G+C含量成正比。含量成正比。nTm=（G+C）%0.41+69.3三、三、DNADNA的復性的復性nDNADNA復性復性(renaturation)(renaturation)的定義的定義 在適當條件下，變性在適當條件下，變性DNADNA的兩條互補鏈可的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構象，這一現象稱為恢復天然的雙螺旋構象，這一現象稱為復性復性。 熱變性的熱變性的DNADNA經緩慢冷卻后即可復性，經緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為這一過程稱為退火退火(annealing) (annealing) 。n減色效應減色效應 DNA

5、DNA復性時，其溶液復性時，其溶液OD260OD260降低。降低。DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子變性變性 復性復性 不同來源的不同來源的DNA分子分子復性的速度受到諸多因素的影響：復性的速度受到諸多因素的影響：1.1.核酸分子的濃度：一般適宜的探針濃度為核酸分子的濃度：一般適宜的探針濃度為 0.10.10.5g0.5g。 2.2.核酸分子的長度：核酸探針的長度控制在核酸分子的長度：核酸探針的長度控制在 5050300bp 300bp 3.3.溫度：適宜的復性溫度是較溫度：適宜的復性溫度是較TmTm值低值低2525。4.4.離子強度：離子強度過低，不利于復性。離子強度：離子強度過低，不利

6、于復性。5.5.核酸分子的復雜性。核酸分子的復雜性。 第第 二二 節節 核酸分子雜交的基本方法核酸分子雜交的基本方法核酸分子雜交的類別核酸分子雜交的類別 （一）（一）DNADNA印跡技術印跡技術 (Southern blotting)(Southern blotting) 用于用于基因組基因組DNADNA的定性定量分析、酶切圖譜分的定性定量分析、酶切圖譜分析、基因突變分析及限制性片段長度多態性分析析、基因突變分析及限制性片段長度多態性分析（RFLPRFLP）等。）等。（二）（二）RNARNA印跡技術印跡技術 (Northern blotting)(Northern blotting) 用于用于

7、RNARNA的定性定量分析。的定性定量分析。 蛋白質的印跡分析蛋白質的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白質定性定量及相互作用研究。用于蛋白質定性定量及相互作用研究。n其他其他n斑點印跡斑點印跡 (dot blotting) (dot blotting) n原位雜交原位雜交 (in situ hybridization)(in situ hybridization)（一）（一）Southern 印跡雜交印跡雜交 nDNA 印跡nE. Southern1975 年方法方法1. 酶解酶解DNAn限制性內切酶（限制性內切酶（Restriction Enzyme, RE）n限制性片

8、段長度多態性（限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）n在人類基因組中，平均約在人類基因組中，平均約200對堿基可發對堿基可發生一對變異（稱為中性突變），中性突生一對變異（稱為中性突變），中性突變導致個體間核苷酸序列的差異，稱為變導致個體間核苷酸序列的差異，稱為DNA多態性多態性。不少。不少DNA多態性發生在限多態性發生在限制性內切酶識別位點上，酶切水解該制性內切酶識別位點上，酶切水解該DNA片段就會產生長度不同的片段，稱片段就會產生長度不同的片段，稱為為限制性片段長度多態性限制性片段長度多態性。2. 分離分離n電泳電泳

9、 在電場中帶電粒子向帶符號相在電場中帶電粒子向帶符號相反的電極移動的現象稱為反的電極移動的現象稱為電泳電泳（electrophoresis）。 =3. 凝膠中核酸的變性凝膠中核酸的變性n堿變性堿變性n中和處理中和處理4. 轉膜轉膜n硝酸纖維素膜n尼龍膜轉膜方法轉膜方法n毛細管虹吸印跡法毛細管虹吸印跡法n電轉印法電轉印法n真空轉移法真空轉移法毛細管虹吸印跡法毛細管虹吸印跡法電轉印法真空轉移法5. 雜交雜交n預雜交：預雜交：封閉非特異性封閉非特異性DNA位點。位點。n雜交雜交6. 雜交結果的檢測雜交結果的檢測放放射射自自顯顯影影照照片片Southern 印跡的應用印跡的應用n基因診斷基因診斷n法醫

10、學法醫學 DNA的多態性。的多態性。 微衛星微衛星DNA和小衛星和小衛星DNA等是重要的多態性等是重要的多態性標志。標志。 單核苷酸多態性（單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNP) DNA指紋（指紋（DNA finger-print）分析的基分析的基本流程如下：本流程如下：DNADNA的提純與純化的提純與純化限制性內切酶消化限制性內切酶消化電電泳分離泳分離分子雜交分子雜交指紋圖的顯示指紋圖的顯示假設一對夫妻，生了一男一女，又領養了一個女孩，妻子還假設一對夫妻，生了一男一女，又領養了一個女孩，妻子還帶來與其前夫所生的女兒。這一家人的帶來與其前夫所生

11、的女兒。這一家人的DNA指紋如圖所示。指紋如圖所示。由此可推斷出：由此可推斷出：A和和C是親生兒女；是親生兒女；B為妻子和其前夫所生；為妻子和其前夫所生；D為養女為養女 （二）（二）Northern blot和和Southern blot不同在于：不同在于：A：靶核酸是：靶核酸是RNA；B：RNA電泳時，凝膠中加入變性劑，防止電泳時，凝膠中加入變性劑，防止RNA分子形成二級結構；分子形成二級結構；C：電泳結束后直接轉膜。：電泳結束后直接轉膜。三種印跡技術的比較三種印跡技術的比較 (三）原位雜交原位雜交(in situ hybridization) n原位雜交是將分子雜交與組織化學相結原位雜交是

12、將分子雜交與組織化學相結合的一種技術。它是利用標記的已知核合的一種技術。它是利用標記的已知核酸探針，在組織、細胞及染色體上檢測酸探針，在組織、細胞及染色體上檢測特異的特異的DNADNA或或RNARNA序列的核酸雜交技術。序列的核酸雜交技術。 主要過程：n制備標記的核酸探針制備標記的核酸探針: : 長度一般為長度一般為5050300bp300bp。n標本的制作與處理標本的制作與處理: : 注意注意防止核酸丟失、保持形態結防止核酸丟失、保持形態結 構、保證探針穿透到達靶區。構、保證探針穿透到達靶區。n原位雜交原位雜交: :DNADNA探針雜交可在探針雜交可在2-42-4小時內完成，而小時內完成，而

13、RNA RNA 探針雜交則應過夜。探針雜交則應過夜。n雜交信號的顯示和結果分析。雜交信號的顯示和結果分析。 熒光原位雜交圖熒光原位雜交圖 （四）溶液雜交（四）溶液雜交(Solution hybridization)n核酸酶核酸酶S1 保護分析法保護分析法(nuclease S1 protection assay)nRNA酶保護分析法酶保護分析法(RNase Protection Assay，RPA)1. 核酸酶核酸酶S1 保護分析法保護分析法合成單鏈合成單鏈DNA探針探針與與RNA樣品進行雜交樣品進行雜交DNA/RNA核酸酶核酸酶S1降解降解DNA和和RNA單鏈單鏈放射自顯影放射自顯影2. R

14、NA酶保護分析法酶保護分析法制備標記制備標記RNA探針探針RNA/RNA與待測與待測RNA雜交雜交RNase T1 和和RNase A降解單鏈降解單鏈RNA電泳電泳第三第三 節探節探 針針n探針探針 (probe) 一小段用同位素、生物素或熒光染料一小段用同位素、生物素或熒光染料等標記其末端或全鏈的已知序列的多等標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在聚核苷酸，與固定在NCNC膜上的核苷酸膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。在。一、核酸探針的來源一、核酸探針的來源n 基因組基因組DNA探針探針n cDNA探針探針n RNA探針探針n 寡核苷酸

15、探針寡核苷酸探針組織或細胞染色體組織或細胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉化菌含重組分子的轉化菌限制性內切酶限制性內切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫存在于轉化細胞內存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNA的集合的集合* 基因組基因組DNA文庫文庫目目 錄錄mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫文庫 逆轉錄酶逆轉錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復制復制* cDNA文庫文庫逆轉錄酶逆轉錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿

16、水解堿水解 T T T T目目 錄錄二、核酸探針的標記物二、核酸探針的標記物 高度靈敏性；高度靈敏性；n標記物與核酸探針結合，應絕對不能影響核酸探針與模標記物與核酸探針結合，應絕對不能影響核酸探針與模板的結合能力及結合的特異性；板的結合能力及結合的特異性；n當用酶促方法進行標記時，應對酶促活性（當用酶促方法進行標記時，應對酶促活性（KmKm值）無多值）無多大影響，以保證標記反應的效率和標記產物的比活性；大影響，以保證標記反應的效率和標記產物的比活性；n高度特異性；高度特異性；n較高的化學穩定性，保存時間長，標記及檢測方法簡單；較高的化學穩定性，保存時間長，標記及檢測方法簡單；n對環境無污染，對

17、人體無損傷；對環境無污染，對人體無損傷；n價格低廉等。價格低廉等。常用的探針標記物：常用的探針標記物：n放射性同位素：放射性同位素： 3H、32P、35S、125I等。等。n非放射性同位素：非放射性同位素： 熒光、地高辛素、辣根過氧化酶、堿性熒光、地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。磷酸酶等。放射性核素標記物放射性核素標記物（靈敏度極高靈敏度極高）3232P P：釋放：釋放-粒子粒子, ,能量高能量高, ,穿透力極強。穿透力極強。3535S S：3535S S的放射性亦較強，但的放射性亦較強，但-粒子能粒子能量較低，因此其檢測靈敏度較量較低，因此其檢測靈敏度較3232P P稍低。稍低。3 3

18、H H：適用于細胞原位雜交。：適用于細胞原位雜交。125125I I和和131131I I：碘放射性同位素在：碘放射性同位素在7070年代曾年代曾被廣泛應用于核酸探針的標記。被廣泛應用于核酸探針的標記。非放射性標記物非放射性標記物無放射性污染，穩定性好無放射性污染，穩定性好n半抗原：生物素、地高辛半抗原：生物素、地高辛n配體：生物素配體：生物素n熒光素：熒光素：n化學發光物質，可以像放射性核素一樣直接化學發光物質，可以像放射性核素一樣直接對對X光膠片進行曝光。光膠片進行曝光。n光密度或電子密度標記物：如金、銀等，適光密度或電子密度標記物：如金、銀等，適用于細胞原位雜交，可以在光鏡或電鏡下進行用

19、于細胞原位雜交，可以在光鏡或電鏡下進行觀察。觀察。核酸分子雜交信號的檢測核酸分子雜交信號的檢測n放射性同位素標記探針放射性同位素標記探針放射自顯影放射自顯影n非放射性同位素標記探針非放射性同位素標記探針偶聯反應偶聯反應+顯色反應顯色反應常用的探針標記法常用的探針標記法1 1、切口移位切口移位( (平移平移) )法法2 2、引物延伸法引物延伸法3 3、PCRPCR標記法標記法4 4、末端標記法末端標記法切口平移法引物延伸法3 3、PCRPCR標記法標記法4 4、末端標記法、末端標記法eddcbba98876654332100+-)(*&%$!#ZYXXWVVUTSSRQPPONNMLKK

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