1、根據來源、基因序列和氨基酸組成分類I 型干擾素： IFN、IFN、IFN 、IFN 來源：白細胞、成纖維細胞、病毒感染的組織細胞等 功能 ：抗病毒感染、抗腫瘤生長 免疫調節(較弱）其中IFN-為多基因產物，有23種以上的亞型。 II 型干擾素：干擾素（IFNg) 來源：活化的T細胞和NK細胞產生 功能：免疫調節Ø 提高單核巨噬細胞、樹突狀細胞的抗原提呈能力Ø 增強Tc細胞和NK細胞的殺傷活性Ø 抑制TH2細胞形成，下調體液免疫應答Ø 趨化作用Ø 抗病毒和抗腫瘤作用（次要）2. 根據動物來源確定分類，例如人干擾素（HuIFN），小鼠干擾素（MuI

2、FN）。免疫調節作用表現在對宿主免疫細胞活性的影響，如對巨噬細胞、T細胞、B細胞和NK細胞等均有一定作用。l 對巨噬細胞的作用：IFN可使巨噬細胞表面MHC類分子的表達增加，增強其抗原遞呈能力；此外還能增強巨噬細胞表面表達Fc受體，促進巨噬細胞吞噬免疫復合物、抗體包被的病原體和腫瘤細胞。l 對淋巴細胞的作用：干擾素對淋巴細胞的作用較為復雜，可受劑量和時間等因素的影響而產生不同的效應。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或將干擾素與抗原同時投入會產生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后加入干擾素則能產生免疫增強的效果。在適宜的條件下，IFN對B細胞和CD8+T細胞的分化有促進作用，但不能

3、促進其增殖。IFN能增強TH1細胞的活性，增強細胞免疫功能；但對TH2細胞的增殖有抑制作用，因此抑制體液免疫功能。IFN不僅抑制TH2細胞產生IL-4，而且抑制IL-4對B細胞的作用，特別是抑制B細胞生成IgE。l 對其它細胞的作用：IFN對其他細胞也有廣泛影響：刺激中性粒細胞，增強其吞噬能力；活化NK細胞，增強其細胞毒作用；使某些正常不表達MHC類分子的細胞（如血管內皮細胞、某些上皮細胞和結締組織細胞）表達MHC類分子，發揮抗原遞呈作用；使靜脈內皮細胞對中性粒細胞的粘附能力更強，且可分化為高內皮靜脈，吸引循環的淋巴細胞。二 重組干擾素的臨床應用l 廣譜抗病毒活性（rhuIFN） 慢性乙型、丙

4、型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。l 直接抗腫瘤活性（rhuIFN） 毛細胞和慢性髓樣白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。l 免疫調節活性治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFN）l 多發性硬化癥 rhuIFN對已知基因序列的干擾素 , 基因文庫的調用可以用其序列 3' 端和 5' 端部分事先用同位素標記過的序列作為探針 , 通過雜交的方法進行調用。由于干擾素基因的種屬特異性不是很大 ,| 可以用人的干擾素基因為同源探針 , 從鼠基因文庫中調出相應的干擾素基因 , 其方法將在下文 1 中提到。 |對于擾素基因的取用 , 不僅可以使用構建基因文庫的方法 , 對已了解其氨基酸或核昔酸

5、割成的干擾素也可以用化學合成的方法先合成其編碼的 DNA 序列 , 再對其進行表達。化學合 | 成方法包括固相合成法及液相合成法兩大類。與利用基因文庫的方法相比 , 化學合成法比較 | 復雜 , 由于每加入一個核昔酸就會有一定比例的錯誤摻入、基因重疊、基因缺失等情況 , 并且在 l 整個合成過程中這種錯誤不斷積累 , 因此該方法適合比較短的基因 , 而對長的基因則有目的產 | 物含量低、產物純化困難的缺點。但它也有優點 , 如可根據研究的需要對一些氨基酸進行定點 | 突變 , 或根據宿主菌的特性 , 在不改變其氨基酸組成的情況下使用宿主的偏愛密碼子 , 以提高 | 產物的產量。 |對于不同亞型

6、的干擾素 , 由于同源性較高 , 可以用相同的引物從誘導的小鼠細胞系中提取mRNA 混合物進行反轉錄和擴增 , 然后用亞型特異性探針對 CDNA 混合物進行 Southern 印跡 , 這樣便可將序列上相差較小的同種、不同亞型的干擾素基因進行分離 , 為生產高純度的單一干擾素提供了方法 O三、表達方法隨著對干擾素研究的深入 , 人們了解到鼠干擾素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的1040 位、 78107 位、 123166 位的 A 、 B 、 C 區 , 尤其是位于 78 和 79 位的氨基酸對抗病毒 | 活性十分重要。而人 IFNt1 的 121136 位對抗病毒活性作用較大 , 人 I

7、FN 子的 N 端 10 個集 | 基酸也是保持其活性所必需的。對干擾素結構的了解為更好地構建基因表達奠定了基礎。干 | 擾素最初是用其外源序列進行表達的 , 但近年來的研究表明嵌合表達的干擾素往往優于單一干擾素 , 因此出現了較多的嵌合表達形式 , 并取得了較好的效果。1.IFN- 的表達家蠶作為一種用于表達外源基因的宿主有易于養殖、生產周期短、夕陽基因表達量高的優點 , 同時由于家蠶為真核生物 , 能對表達產物自行進行糖基化修飾 , 產生有生物活性的蛋白 , 并且在產物提取的過程中只要將家蠶進行勻漿 , 再進行抽提即可 , 操作上十分方便 , 因此 , 它在基因工程領域內被廣泛應用。下面便

8、以人 IFN, 的生產為例介紹家蠶表達體系在干擾素生產中的應用。用家蠶核型多角病毒 BIIINPV 體外感染的家蠶傳代細胞株 BM-N 通過噬菌斑法純化得到 BmNPV 的 3 亞型。利用從感染脂肪體 mRNA 制得的 CDNA 為探針 , 對其多角蛋白序列進行檢驗 , 其中 10.5kb 的 EcoR I 片段及 3.9 燦的 HindE 片段可與探針雜交 , 將 10.5 燦的 EcoR I 片段克隆到 pBR322 中 , 產生質粒 pBmE360 對其用 HindE 切 , 得到 3.9kb 片段 , 其中 | 含有多角蛋白全部序列 ( 圖 123 中為黑色框架 ), 將該片段插入 p

9、UC9 的 HindE 位點 , 產生質 | 粒 p9H18 。將 p9H18 用 EcoR I 切后于 50U BAL31 外切核酸酶緩沖液中 23 水浴 10min, 更 | 掐鍾油油菲如 n 入 07 倍他烈的。氣 mnlAd EDTA 終止反應。將截短的 p9H18 片段用 Hind E i切 , 并通過瓊脂糖凝膠電泳分離 2.7kb 的 Hind 皿平頭末端片段 , 將其插入 pUC9 即 p9B310的 Hind HI-Sma I 位點 O 另外 , 將 pBmE36 的 3.1 峙的 HindE 片段連接到 pUC8 上 , 得到質粒 p8H225, 用 EcoR I 及 Aat

10、 E 切 , 得含有多角蛋白基因下游 3.1kb 基因的 3.5kb 片段 , 將其連接到 p9H18 的 4.7kb 的 EcoR IAat E 片段上 , 產生雜交質粒 p89B310, 它在啟動子下游含有多聚接頭 (EcoR I 、 BamH ISma I 、 Sal I 、 Pst I 位點 ) 。將從基因文庫中用 183bp 探針調出的在 ATG 后含有 Sma I 位點 ( 即有序列 CCCGGGATG) 的 IFNm J 基因片段連接到 p89B310 上 , 便構建成質粒 pIFN2B310 。將 pIFN2B310 與病毒基因組 DNA 便可共轉染 BM- N 細胞系或家蠶幼

11、體 , 其具體操作如下 : 向 2.5mL 含有 0.25molACaCl2 、 10 g BmNPV DNA 及 65 g pIFN2B310 的溶液中加含 0.28II1014NaCl 、 0.7mmoi/L Na2C03 、 0.7IIIII1014 Na2HP04 、 50mmol/L EfEPE (pH 7.1) 的緩沖液 , 進行沉淀。取 0.45ml 沉淀加至 4.5mi 含 3 × 106 個細胞的培養液中 ,12h 后換液一次 , 再培養 4d, 即可得到重組病毒 BmIFN2B310 。用兩個噬菌斑單位的病毒感染 3 × 106 個 BM-N 細胞或用

12、50 L3 × 105 個噬菌斑單位的病毒溶液注人家蠶幼體 , 培養 24h 后收集培養液便可得到干擾素。2.IFN- 目的表達將人 IFN-R 基因 HimdE 片段插人載體 pSV2-dhfr 中 SV40 晚期啟動子 PL 下游的 Pvu E 位點。用此重組質粒與帶有黃瞟嶺磷酸核糖轉移酶 (XGPRT) 基因的質粒 pSU-gpt 共轉染次黃瞟嶺磷酸核糖轉移酶 (HGPRT) 基因缺陷小鼠的骨髓瘤 (sp24) 細胞 O 經過霉盼酸及氨基喋嶺培養基篩選 , 便可得到表達人 IFN-R 。具體操作步驟如下 : 將含有人 IFN-p 基因的重組質粒 pBV-92 用 EcoR I

13、及 Hind E 酶切 , 分別作為探針模板及插入片段 , 同時用 PvuII 切載體 pSVZdhfr 質粒 , 使其線性化后將外源基因插入。將次黃瞟嶺磷酸核糖轉移酶基因缺陷的 sp2/0 細胞在含有 10% 小牛血清、 10% 青鏈霉素的 DLfEM 培養基中傳 34 代后在小空斑瓶中培養 24h, 成半懸浮狀 ,400r/ 勺 1in 離心 5min 將細胞沉積加入新鮮培養基 , 再培養 24h 。轉染液中含目的基因 pSVHIF 和標記基因 pSVZgpt( 比值為 10:1), 其中 DNA 濃度為 20 g/IIIlo 在 2IIIol/L CaCl263 陣、 10mmolATr

14、is-HCl (pH 7.1)428 L 中緩緩加入 2 × HeBs 液 (EEPES50mmol 只 L 、 NaCl280mmolA 、 Na2HP040.75mmolA 、 0.75IIlII1014 Na2HP04,pH 7.1) 約 500 L, 加入 sp2/0 細胞培養物中 , 輕輕搖勻 37 孵育 8h 。再更換為含有黃瞟嶺 250 g/mL 、次黃瞟嶺 15 g/mL 、胸昔 10 g/mL 、氨基蝶嶺。 -2 g/mL 、霉盼酸 25 問 /mL 的 DhEM 培養基 ,37 cq 孵箱中選擇性培養。一周后更換為含 250 g/mL 黃瞟嶺的 D; 舊 M 培養

15、基 , 繼續培養 2 周以上 , 檢查 IFN-P 活性。3.IFN- 的表達以鼠干擾素 MuIFN- 為例 ( 圖 12-3) 。用含人 IFN- 編碼區基因的探針與噬菌體 MG9 構建的鼠 M600 基因組 DNA 文庫在 20% 甲酷膠中進行低嚴格性的雜交 , 膜用 0.3molANaCl 、 0.03II1014 擰棱酸納及 0.1%NaEbS04 在室溫洗滌兩次。將結合的噬菌體用噬菌斑法純化 , 提取 DNA 后 , 用多種限制性內切酶切 , 以 1% 葡聚糖凝膠電泳純化后與人 CDNA 探針雜交 , 將 MG9 中與探針可以雜交的 10.5kb 的 BamH I 片段亞克隆到 pB

16、R322 的 BaIIIH I 位點 , 產生質粒 pMG10.5 。通過電泳分出插入片段大于 6000 坤 , 即含有完整 MuIFN-Y 的質粒 , 用 PvuII 酶切 , 六個切點中有一個位于 5' 端非編碼區 , 取從此切點到第一內元中 Cla I 的 348bp 的片段以及用 Cla I 及 Bgl H 酶切得的 MuIFNm 3F 端片段 O 將載體質粒 p342E 用 EcoR I 及 BamH I 酶切 , 并用聚合酶 I 將 EcoR I 切點補成平頭末端 , 與以上制得的兩個片段混合 , 一同轉化大腸桿菌 294, 選出 AIIIP 抗性菌株 , 從中提取質粒即為

17、含有干擾素編碼基因的 pSVEII111 。用表面活性劑右旋糖所活化 COEL1 細胞 , 將質粒轉入并培養 48h 后離心 , 上清液中便含有干擾素。4. 嵌合干擾素的表達嵌合干擾素大致可以分為兩種類型 : 一種是兩種不同類型或同類型而不同亞型的干擾素間進行嵌合 , 另一種是干擾素或其部分序列與其他活性物質 , 如抗體、白介素等進行嵌合 , 以便得到新的生物活性產物。下面就這兩種情況分別舉例介紹。將從基因文庫中調出的編碼淋巴細胞干擾素 B 和 D 的 CDNA 連接到大腸桿菌色氨酸啟動子、操縱子、核糖體結合位點及起始密碼子 ATG 后面 , 分別構成表達載體 pLYEN-B 和 PLy- I

18、FN-D 。為構建嵌合干擾素 , 可先將親代干擾素的編碼序列在相同位點 S1(Sa113A I ) 、 Pv(PVUE) 、 S2(Sa113A I ) 切斷 , 產生含有氨基端 160 、 192 、 6192 、 93150 、 93166 、 151166 位氨基酸的片段 , 用 6% 的聚丙烯釀膠凝膠電泳分離 ( 圖 124) 。將合適的片段連接 , 得到嵌合DNA, 將含有嵌合 DNA 的質粒用 HindE 和 Pst I 切后將酶切片段連接到 pBR322 的 HindEm pst I 位點上 , 將得到的表達載體轉入大腸桿菌中 , 同時對 DNA 序列進行測定。含有轉入質粒的大腸

19、桿菌 HT-2 在 M9 培養基中培養到 OD650 為 58 時 , 離心得到細胞 , 并用含 100mmoIATris-HC1 、 0.5molANaCl 、 5mmolAEDTA 及 0.1IIIEnol/L PMSF 的 pH 為 8.0 的緩沖液重新溶解之。在 0 加入 1mg/ml 溶菌酶 , 細胞在溶菌液中裂解。離心后將上清用單克隆抗體親和層析柱純化兩次 , 將純化后的活性干擾素溶于 PBS 后利用超濾膜 YM10 濃縮至 13 時 , 再將濃度調整到 0.1/IIIgmlo 利用 SDS 聚丙烯酷膠電泳對于擾素的純度進行測定。IFN- 及 TNF-R 基因已經分別被克隆 , 并

20、用工程菌加以表達。對其序列的研究表明 , IFN-R 在竣基端的 13 個氨基酸以及 TNF- 下在氨基端的 23 個氨基酸均對它們的生物活性沒有影響 , 因此在設計構建 IFN- 與 TNER 嵌合物時可以將其去除 , 利用色氨酸啟動子構建的含有 IFNE 氨基端 134 個氨基酸及 TNF-P 竣基端 148 個氨基酸的表達質粒結構見圖 12-50此外 , 基因工程在抗體技術上的應用使干擾素與抗體能夠有機地結合 , 通過抗體的靶向作用 , 增強干擾素的定向能力 , 提高干擾素體內作用的效率。5. 提高干擾素產量的方法干擾素是一種誘生物質 , 必須在一定的誘生劑如病毒、細菌等作用不才能生成

21、, 所以在基因工程中 , 常常用一些強啟動子如色氨酸啟動子 , 將干擾素的表達從條件型變為組成型 , 以提高產量。酵母是一種較為常用的表達宿主 , 但其外源基因的大量表達必須在缺少元機磷的條件下才能進行。通過對其酸性磷酸酶酶的阻遏基因及溫度敏感型負調控基因進行改造 , 就可以使酵母菌在 35 的高溫下生長 , 在 25 下誘導表達 , 并且其表達與無機磷的含量無關。實驗表明未誘導時產量為 6 × 104UA, 而誘導后產量可達到 1 × 107UA 。由于 IFN- 、自、性質各異 , 在進行表達時 ,IFN 干的產量往往遠不及 IFN- 、 IFN- 日 , 因此就必須進

22、行表達體系的改進。如利用含噬菌體 T5 早期啟動子及強核糖體結合位點的高效轉錄二表達體系 , 可以使 IFN- 的表達也達到 4 × 109U/L 的水平。其方法為用人工合成的 T5P25 強啟動手 其中含有啟動于及核糖體結合位點 ): 取代質粒 pJP1 在 EcoRV 與 HindE 之間的 Tef 啟動子 , 形成質粒 pJR1R3, 將其用 HindE 線性化后插入 IFNEY 的編碼序列 , 便可以得到高效的表達質粒 IFN -IFNY 。將 IFN 基因置于 Tetr 基因的上游 , 有利于轉化質粒的篩選和保持 ( 圖 12-6)O其中合成的啟動區序列為 :ER I35

23、區-10 區GAAITCAAAAATrrA TTGCTT AGGAAAAATTTTI IGTATAATE 丑 nd 皿AGAI ATAAATTTGAAGCTAGGAGGTTTAAGCTT啟動子核糖體結合位點四、提取、純化及鑒定對干擾素的提純可分為粗提和進一步純化 , 以 IFN- 為例 , 粗提時將菌液 5000r/min 離心取細胞 , 加入 1/100 體積的 7mol/L 鹽酸肌冰浴 2h 裂解細胞后 17000r/min 離心 5min, 取上清液。用 510 倍體積的 0.15mol/L 棚酸鹽緩沖液稀釋后在 1OIIIII1014 的 NH4Ci 中透析 20h, 再 15000r

24、/min 離心 10rIlino 將上清液用 80%(NH4)2S04沉淀 , 用水溶解后再透析去除 (NH4)2S04, 再用離子交換的方式分離各種蛋白 O 如果要進一步純化 , 可用單克隆抗體進行親和層析。將 Sepharose4B 與純化的抗 IFN- 單克隆抗體混合振搖 , 室溫放置 4h 后低速離心 , 并用 0.1Enol/L= N 注 fC03(pH8.5) 的緩沖液洗去未結合的抗體 , 加入等體、積的乙醇膠并振蕩 4h 以上 , 將殘存的活性基團加以封閉 O : 用 pH 4.0 的醋酸鹽緩沖液及 pH 8.0 的 Tris-HCl 緩沖液交 i替洗滌 3 次 , 并用 pH

25、7.5 的 0.1molATriSEHCi 加以平衡 1 后裝柱。用 pH 7.2 的 0.01molJL PBS 洗柱至洗脫液 OIh80 到基線 , 將含有 IFN 的混合液上樣 , 如一次吸附不完 A 全可用流出液再上柱一次。用 PBS 反復洗柱 , 至流出液的 1 吸收回到基線。用 pH 2.5 的 0.1molA Gly-HCl 洗脫并分 4 段收集 , 并對各部分濃度進行測定。最后用 pH 2.5 的 0.1molA Gly-HCl 再生 , 用含 0.01% 間的 PBS 沖洗凈 ,4 保存。同時 , 利用親和層析技術還可以對只占總蛋白 0.1%1% 的干擾素進行分離和濃縮。五、

26、活性檢測1. 對 (3 二 5')oligo(A) 合成酶活性的誘導在含 1% 小牛血清的 RPMI1640 培養基中培養 2 × 105 個 /ml Daudi 細胞 , 并分別加入 1U/m1 、 10U/ml 、 100U/ml 、 1000U/ml IFN 。 24h 后 9000r/ min 離心 2min, 并將沉淀分散于 500 L 冷的含 20mmoiAEfEP- ES 、 5mmol/L MgCl2 、 I20mmol 只 L KCl 、 7mm014 二硫蘇糖醇、 10% 甘氨酸、 05%NP40(pH7.5) 的裂解液中 , 冰浴 2min 后 9OOO

27、r/min 離心 8IIlino 取上清與 50 L poly(rI):poly(rC) 瓊脂在 30 共浴 15min, 離心去除未吸附部分 , 而將結合物與 2.5mmolA -32p-ATP 及磷酸激酶在 30 水浴 20h 。將混合物上 30 L 酸性磯土柱 , 用 3mllmolA 鹽酸肌洗脫 , 將洗脫液與未用 IFN 誘導的對照組進行比較便可測出 IFN 的活性。2. 抗增生活性在含 15% 小牛血清的 RPMI1640 培養基中培養 5 × 104 個 /ml Dauda 細胞 ,48h 后加入 IFN, 再培養 72h, 用 2BI 型庫爾特計數器對細胞進行計數 ,

28、 即可以得到 IFN 的抗增生活性。3. 細胞病變抑制作用將在含 10% 小牛血清的 DMEM 培養液中培養的 WISH 細胞用 0.03%EDTA 、 0.25% 的膜蛋白酶 1mi 在室溫下消化 23min 后 , 倒出消化液 , 用 Eagle 液分散細胞 , 然后用含 10% 小牛血清的 DMEM 液配成 5 × 105 個 /ml 的細胞懸液 , 用微量板在37 含 5%C 馬的培養箱內培養過夜。用不同稀釋度的 0.1ml IFN 溶液加入各孔后再培養 7 h 。每孔加入 0.1ml 含 1001000TcID50 濾過性口腔炎病毒 (VSV) 進行病毒攻擊。將病毒對照組與

29、細胞對照組進行比較便可以測得其抗病毒活性。六、新型干擾素1. 活性增加的干擾素通過定點突變或干擾素的嵌合可提高干擾素的活性 , 如將重組干擾素自 17 位的 Cys 改為 Ser, 可提高抗病毒活性 10 倍。新型雜合的 IFN- D 對 NK 細胞的調節能力比親本提高了 10400 倍 , 如將 IFN- 4 與 IFNtl 進行嵌合 , 得到的 IFN 活性分別是親代的 4 倍及 20 倍。而用鼠 IFNt1 的 A 段與 IFN- 飩的 B 段進行雜交 , 活性可提高 10100 倍。此外 , 如上面介紹的將 IFN 與 TNF 結合 , 可以產生不同的活性。2. 穩定性增加的干擾素仍以

30、上面提到的重組 IFN R 為例 , 親代干擾素在一 70 75d 后大多數喪失抗病毒活性 , 而突變后在同樣條件下保存 150d 仍不失活。3. 改變抗原性的干擾素如將 IFN 仇的 141 位上 Cys 用 Tyr 代替 , 則其抗原性發生改變 , 不與體內自然存在的 IFN 在 1 爭奪受體 , 雖然這種抗原性改變的機率很小 , 但仍不失為一種研究方向。4. 改變種屬特異性的干擾素IFN- D 在牛細胞株中活性最高 ,IFN- A 在人細胞系中活性最高 , 而其嵌合體與兩個親本都不相同 , 在鼠細胞中的活性最高。第三節應用一、臨床治療方面干擾素作為較早被研究的用基因工程方法合成的生物活性物質 , 雖然在基因的調取、構建、表達方面仍有較多的工作在進行中 , 但研究的熱點已經轉移到了臨床應用及臨床前的動物實驗方面 , 并且在較多疾病的治療方面取得了進展。1. 抗病毒目前的研究主要集中于抗各類肝炎病毒方面 , 在抗 HIV 、抗 HSV 等方面也有較多的研究。2. 提高免疫系統機能在小鼠實驗中重組 IFN- 對 NK 細胞的活性、吞噬細胞的溶解性、絲裂原誘導的母細胞化均有促進作用 , 同時減少外周血