1、 題目題目 Regulation of alcohol oxidase 1 (AOX1) promoter and peroxisom biogenesis in different fermentation processes in Pichia pastoris 畢赤酵母不同發酵進程中乙醇氧化酶啟動子和過氧物酶體生物合成 的調控規律 文章來源：Journal of biotechnology 1背景介紹 2實驗材料和方法 3實驗結果 4結論與分析 1.2過氧物酶體(Peroxisome)：遍布于真核生物的細胞器中, 用來去除有害物質. 它們用外表的單層膜與細胞的原生質分隔開來, 膜上有功能

2、重要的膜蛋白, 用以向細胞器中輸入蛋白質和促進細胞分裂. 與溶酶體不同的是, 過氧物酶體不是由分泌通路產生, 而是通過先漲大后分裂的自我復制過程產生, 當然也有證據顯示新的過氧物酶體可以直接產生. 過氧物酶體是由比利時細胞學家德迪夫(Christian de Duve)在1965年發現的. 1.1醇氧化酶AOX1基因啟動子作為甲醇誘導的強啟動子,在Pichia pastoris表達系統生產重組蛋白中得到廣泛應用。P.pastoris中的轉錄因子通過特異的順式作用元件與啟動子相互作用而影響基因的轉錄,因此通過調節AOX1基因啟動子的活性可以控制下游基因的表達 背景介紹 1. 3GFP-SKL（過

3、氧化物酶體定位蛋白）,該載體含有融合了過氧化物酶體定位信號1(PTS1)的綠色熒光蛋白報告分子GFP-SKL編碼基因 成功地用于描述不同 時間進程的AOX1啟動子和過氧物酶體生物合成因素的特征 1.4泛素蛋白（細胞液中的短周期熒光蛋白）泛素(ubiquitin)是一種存在于大多數真核細胞中的小蛋白。它的主要功能是標記需要分解掉的蛋白質，使其被水解。當附有泛素的蛋白質移動到桶狀的蛋白酶的時候，蛋白酶就會將該蛋白質水解二：實驗材料和方法2.1：質粒的構建表達GFP- SKl pGLY11245或pGLY13173 轉化YGLY27355或YGLY31884 YGLY14836生產單克隆IgG1抗體

4、 表達Ub-R-GFP pGLY10148轉化 YGLY19309或YGLY29325 生產單克隆IgG1抗體 2.2：轉化：畢赤酵母感受態的制備和電轉化的方法（參見nvitrogen公司的Pichia酵母表達手冊）2.3：補料分批培養條件 研究了三種不同發酵條件下的PpAOX1啟動子（ YGLY29325 ）和過氧化物酶體生物合成（ YGLY31884 ）的調控。 誘導階段分批補料條件 ML:甲醇的起始供應速率為2.6gl/lh然后在0.0063/h的基礎上以冪指的形式增加 SML:甲醇培養20h用50%的葡萄糖15g/h的速度培養8h作為一個周期共培養3個周期 OL:甲醇進料保持反應器中甲

5、醇1，每當DO迅速增加，這表明甲醇消耗。 DO級聯被打開，關閉和攪拌速度 被減小到實現氧氣的限制2.4 GFP表達的定量和可視化： 約107固定的酵母細胞經PBS洗后用mounting solution重懸制作切片用Axioscope 2 Plus 顯微鏡來觀察OpenLAB軟件來實現相機控制和圖像收集Volocity軟件用來量化GFP在細胞中的強度 2.5抗體效價的測定 在培養上清液中于280nm處抗體濃度用二極管陣列檢測器和蛋白A親和柱與HPLC系統2.6:細胞裂解 從畢赤酵母細胞釋放細胞外的DNA使用 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 雙鏈DNA檢測試

6、劑盒檢測3實驗結果與討論 通過熒光顯微術 UB - R- GFP和GFP- SKL被正確地定位于細胞質和過氧化物酶體，符合預期 3.1: 3.2:YGLY29325的三種不同的補料分批發酵條件的取樣數據(a) 甲醇限制 (ML); (b) 葡萄糖培養8h甲醇培養(20 h) (SML); (c) 氧氣限制并額外增加1%甲醇（OL）DO (%) ：黑色直線，甘油或葡萄糖：藍色,甲醇:紅色。細胞濕重：黑色三角 3.3畢赤酵母AOX1啟動子（YGLY29325）根據三種不同的補料分批條件規制 - 甲醇 - 限制（ML），切換與葡萄糖和甲醇（SML）和氧氣限制（OL）補料分批條件。 （a） GFP熒光

7、表達圖像（b）不同誘導時間的熒光蛋白相對密度。對于ML和OL，時間表示分批階段（T1），甘油補料分批階段誘導前（T2）和誘導期（T3，102小時; T4中，362小時; T5，622小時; T6，842小時）。對與SML條件下，細胞生長是在T2，T4和T6 葡萄糖階段，誘導是在T3和T5甲醇階段 3.4：ML，OL，及（b）SML - 過氧化物酶體的生物合成三種不同的培養條件下比較。 SML：切換葡萄糖和甲醇進料。在過氧化物酶體中使用GFP-SKL（YGLY31884）進行定量測定。數據點表示在兩個獨立的運行平均值。星號（*）表示甲醇階段 3.5三種不同的工藝條件下（YGLY29325）發酵特

8、性 - ML，OL和SML。 （一）細胞的密度分布（gWCW/ L）; （二）細胞列解指數（毫克 DNA/ L）; （三）抗體效價（毫克/升）; （d）OL條件下延長誘導時間的細胞密度和抗體效價。 3.6 在甲醇補料階段的代謝過程（a）甲醇限定（ML）（b）氧受限（OL）條件下補料分批巴斯德畢赤酵母的培養。4結論與分析 在這項研究中，我們調查AOX1啟動子和過氧化物酶體如何被調節以響應碳源（例如甲醇）和氧氣分子的可用性 在蛋白質生產階段，以更好地了解在畢赤酵母發酵常用的工藝條件。AOX1啟動子是在ML最活躍下，但OL下不太活躍。過氧化物酶體的生物合成顯示對甲醇的消耗高度依賴。在碳限制補料流加過程中過氧化物酶