1、MTT試驗中的諸多問題細胞：1.選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。2.藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。3. 時

2、間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現的最明顯）。4.培養時間。200ul的培養液對于10的45次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48h換液的。5.MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。6.理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。7.實驗時應設置調零孔，對照孔

3、，加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物。8.避免血清干擾。用含15胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10胎牛血清的培養液進行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。實驗步驟貼壁細胞：1.收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2.5%CO2，37孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，

4、細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況3.5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。5.終止培養，小心吸去孔內培養液。6.每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7.同時設置調零孔（培養基、MTT、二

5、甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）懸浮細胞：1）收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將補足的1640（無血清）培養基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養液稀釋 l?g/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；需檢測物10ul；細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100?(儲存液100 1640）。2）置37，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/

6、ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）4）離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。5）同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。MTT的配制MTT一般最好現用現配，過濾后4ºC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存

7、在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.配制MTT時用用PBS<ph=7.4>溶解,也有人用生理鹽水配，60水浴助溶。PBS配方:Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g調

8、ph 7.4定容1L關于細胞的接種(鋪板)細胞過了30代以后就不要用了,因為狀態不好了;培養板要用好的（最好進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種, 因為細胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現的線性關系最好，結果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯，太密細胞可能都會凋亡，因為細胞長的太快營養會不夠，最后導致死亡。且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。細胞密度要根據不同細胞的特點來定.如果你做的藥品對細胞具有刺激作

9、用那么取小點的細胞濃度，如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點的細胞濃度，這樣與對照的區別更明顯，數據更好。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105,貼壁細胞可為103-104.其它的聲音：1.首先細胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個左右就夠了，我認為寧少勿多。尤其是對于腫瘤細胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現不出的，最佳點板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。2.MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手，20的波動也是常見的，所以很可能是技術原因引起的，特別是種板技術一定要過關。3.我做的是腫瘤細胞的MTT

10、實驗,這種細胞長的很快一開始我是用100000/ML的濃度來接種的,結果細胞長的太滿結果是沒有梯度也沒有線性關系.后來調整濃度,用過4000080000/ML的濃度都做過MTT實驗,結果發現做的結果比較好點的是6000070000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組,由于細胞少,藥物作用的梯度還是有,只是沒有很好的線性關系.還有根據細胞生長速度以及藥物的特性(有時間依賴性和濃度依賴性的藥物)來確定培養時間是48小時還是72小時.注意細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多

11、，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。另外，吹散次數過多也會影響細胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。首先說說我的一點經驗：1.吹打時懸液總量不能太多，達到吸管吸液量的3到4倍，可能比較容易混勻。10ml的離心管里面最好裝34ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細胞懸液。2.吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量過多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會不均勻。如果是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益3.吸的時候要在懸液底部，然后提起來一點，但是吹下去的時候不要離開液面，否則容易吹打出氣泡。4.吹打次數100

12、左右，就可以吹打均勻了（有人認為加細胞前吹打3050次基本就差不多均勻了。加細胞的時候每接種2孔反復吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細胞懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液。）5.向每孔中用槍頭加入細胞時不要太快，否則你會發現細胞在加入的瞬間會由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會產生接觸抑制，影響細胞的生長。所以速度不能太快也不能太慢。我習慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復3下移動，目的是使得細胞能分散的均勻些。（鋪板技術是MTT實驗的關鍵，也是基礎，一定要練好。曾經有同學用漩渦振蕩器混勻細胞，最后細胞全死了，建議不要采用這

13、種方法混勻細胞。加入MTT個人認為MTT最關鍵的是你的細胞數目和你加入真正起作用的的MTT的適當比例，具體細胞數目和真正起作用的的MTT之間的關系確實不好確定，我認為MTT多加一些比少加好一些MTT的量各家報道不同，一般是過量的，所以10ul即夠了。如果不使用96孔板，培養基超過100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振蕩一下讓MTT與培養基混勻，不過這個應該關系不大。如加入MTT后都有個別孔立即變為藍黑色，則污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的因為血清中白蛋白對大部分的藥

14、物都有結合效應，所以可以單獨將藥物和MTT加在一起，看會不會起反應。如果不起反應，就不用去除含藥物的培液，直接加MTT即可。如何清除上清百家爭鳴：1.加DMSO前要把液體吸掉，但培養液里的紫色結晶可能會吸去，可在這之前先用平板離心機離心96孔板，2000r，5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細胞，則推薦此法,懸浮細胞要離心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圓底型96孔板,清除上清時注意不要把下面的結晶顆粒吸掉,建議各孔吸棄150-160ul即可)。2.我每次將MTT加入后，再孵育四個小時，然后用離心機離心1000G,5min。但是用槍小心地吸上清，還是會將一小部分藍色結晶吸

15、出。所以還是建議翻轉倒扣的方法吧！3.另外，可以直接將板翻轉倒扣（墊幾層濾紙）23次，比用“吸”的辦法更不容易使細胞脫離出來。可以輕拍，或者傾斜一點幫助吸液，發現紫色結晶幾乎沒有肉眼可見的掉脫，但前提是你本身細胞貼壁要比較牢，半貼壁生長的細胞容易脫離。假如藥物作用時間長的話，陰性對照組可能由于細胞過多而使加入后形成的結晶漂起來，這樣就不能直接倒掉上清。4.做MTT時，這一步驟一定要小心，不要采用倒的方式。因為貼壁不牢的細胞會被倒掉，從而影響OD值。懸浮細胞，不要翻板，離心后也不要翻板，這個方法害死人。5.加完MTT反應34h后，從培養箱取出96孔板的動作要輕柔，避免振蕩結晶,使其滑落.你可以試

16、著將96孔板傾斜30度角，然后用槍尖慢慢吸，有的細胞可以用排槍一起吸，有的則要耐心的一個個用槍頭吸，槍尖的力度和方向要保證每個孔都一致。不要讓槍頭接觸到孔底，且一旦傾斜孔板后就不要反復傾斜放平，這樣也會使結晶脫落。6.用醫用的注射器加上針頭吸取液體的，吸取時要把板子斜放，沿著壁吸取就好了！這次MTT我用1ml針頭仔細吸培養液,覺得比其它方法可靠,一般不會吸走紫色結晶.避免清除上清而改進的方法由于一般可離心96孔板的離心機不好找。既使是貼壁細胞做MTT時，用DMSO溶解得到結果也不好，不是得不到預期結果就是可重復性差。解決方法1:用以下文獻方法：周建軍等，評價抗癌物質活性的改良MTT方法，中國醫

17、藥工業雜志，1993，24（10）：455-457具體方法：配三聯溶解液：10%SDS，5%異丁醇，0.012mol/LHCL，蒸餾水溶解。三聯溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用雙蒸水溶解配成100ml溶液操作：在培養板上加一定密度的細胞懸液，90ul孔；如需給藥，則再于同時(懸浮細胞)或4h后(貼壁細胞)加入不同濃度的藥物10ul孔，均設三復孔。另外，每塊板上另沒一個調零孔(只加培養液，不含細胞和藥物)。培養2d后，加入MTT溶液20ul孔，繼續培養4h，然后加入上述三聯液100ul孔，于37度放置過夜后，用酶標儀測各孔A570值。優點：簡化操作，提高了可靠性。

18、解決方法2：日本同仁有一種新試劑CCK-8試劑， CCK-8試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST8其化學名稱為：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲 染料（Formazan dye）。生成的甲 物的數量與活細胞的數量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。CCK-8試劑中已預先配入了進行細胞增殖和毒性分析所需的成分，無需再用緩沖液或培養基進行稀釋

19、；同時，CCK-8試劑無需任何放射性同位素和有機溶劑。因此，無需特別的技巧，就可使每一位使用者準確、快速地得到重現性好的實驗結果。優 點1、簡 便 只需一步即可得到結果2、省 時 毋需預制，即開即用3、安 全 毋需放射性同位素和有機溶劑4、快 速 省去了溶解除沉操作5、靈敏度高 靈敏度高于MTT6、重現性好 步驟少；無損失；結果準確就是比較貴，如果經費充足，用這個是不錯的。進行細胞增殖分析的使用方法:1、接種細胞懸液100l于96孔板內，預先置于37，5% CO 2飽和濕度培養箱內培養。2、在每個孔內加入10l的CCK-8試劑。3、把培養板放在培養箱內培養1-4小時*。4、在450nm波長處測

20、定吸光度，參比波長為600nm或600nm以上。解決方法3：使用MTS解決方法4：加入DMSO在同一批實驗中最好不要更換DMSO。加DMSO前把孔中液體盡量棄干凈，沒有去掉上清直接加DMSO，一是沉淀會很難溶解.二培養液的顏色在檢測時也能被測到,會對最后結果造成影響。但前提是不能把細胞也一起吸掉，因為這樣帶來的誤差要遠遠大于培養液沒棄干凈帶來的誤差,所以要在保證細胞不被吸掉的前提下，盡量把培養液吸掉。如果培養液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養液，這樣在檢測時可以盡量去除培養液的影響，DMSO的量也可為100ul或150ul.1.加了DMSO后用振蕩器輕輕振蕩510min, 時間控制盡量嚴格一

21、點,放置時間長了會影響結果,值會偏大,且結果不可信.2.加入DMSO后可用排槍反復抽吸助溶，溶解后盡快檢測。如果實驗孔不多，建議用此法，因其比振蕩溶解效果好。3.或放入37度放孵箱15分鐘溶解結晶。振蕩是為了讓甲臜溶解，這樣才能更好的測量吸光度，振蕩96孔板有專的振蕩器，目的:扎破氣泡.有氣泡存在時,由于其對光的反射與折射作用(酶標儀的原理是通過測定特定波長透過樣品的吸光度推測樣品內特定物質的濃度),會導致結果偏移.OD值的測定至于測定波長的選擇是因顯色溶液而異的，對于DMSO，溶解后呈紫（紅）色，490nm有最大吸收值,而ATCC公司的MTT試劑盒用的不是DMSO，它的測定波長是570。(就

22、如ELISA實驗選用OPD作底物測定波長是492，選用TMB顯色液則用450);而對于SDS和酸化異丙醇，則選用570nm，并且建議以655nm作為參考波長。DMSO溶后10分鐘內測，越放顏色越深，而做為溶解液測吸收光值，其值可在三天內保持不變.細胞密度偏大測出的吸光度也會偏大，細胞密度小吸光度也會偏小；另外跟細胞狀態也有關系，細胞狀態不好的話，吸光度值也會低的；細胞數目少，或者是培養的時間短，OD值也會偏低。如果各個孔的孔間差異性特別明顯的話說明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是細菌污染。復孔直接的OD值差別一般應在0.10.15，差別太大考慮：1.接種細胞數不均勻，或是接種太多，

23、應保證每孔一致，一般是每孔100010000個。可以細胞細胞計數后，加入細胞懸液，再補培養基到預定體積，并輕輕吹打幾次，使細胞均勻分布，這樣比直接加入預定體積的細胞懸液要好，接種時應加含血清培養基。2.貼壁時間：1824h，如果不夠，未懸浮的細胞會被吸掉。一般為了實驗的準確，每個濃度可以設56個復孔，可以最后統計時，可以除去一個最高值和一個最低值，或者除去其中數據離譜的值，這些離譜數字的出現與細胞是否污染，細胞是否在培養期間死去，是否培養液蒸發過多，加MTT液是否準確，在37，5二氧化碳培養箱中孵育時間是否一定（14小時）等有密切的關系，當然測定OD值的儀器工作狀態是否正常也非常重要！(一般開

24、機預熱20min)。MTT方法的吸收度在0.20.8之間誤差較小。這和分析化學中的-beer定律有關， 對朗伯-比爾定律的偏離在吸光光度分析中，經常出現標準曲線不呈直線的情況，特別是當吸光物質濃度較高時，明顯地看到通過原點向濃度軸彎曲的現象（吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進行定量，將會引起較大的誤差。在吸光光度分析中，儀器測量不準確也是誤差的主要來源。任何光度計都有一定的測量誤差。這些誤差可能來源于光源不穩定，實驗條件偶然變動，讀數不準確等。在光度計中，透射比的標尺刻度均勻。吸光度標尺刻度不均勻。對于同一儀器，讀數的波動對透射比為一定值；而對吸光度讀數波動則不

25、再為定值。吸光度越大，讀數波動所引起的吸光度誤差也越大透射比很小或很大時，濃度測量誤差都較大，即光度測量最好選吸光度讀數在刻度尺的中間而不落兩端。待測溶液的透射比T在15%65%之間，或使吸光度A在0.20.8之間，才能保證測量的相對誤差較小。當!/url<font color=#ff0000>謝絕廣告帖！再發封ID！</font>0.434(或透射比T=36.8%)時，測量的相對誤差最小。其它的聲音：1.最好用570nm波長的濾光片，因為MTT在這個波長的吸光度是峰值，換句話說靈敏度高。用其它波長的也有，一般是490nm，但我的經驗靈敏度降低一半。2.我們用的BIO-

26、TEK公司的ELx800,一般值在2以下都是可靠的,如果復孔之間值相差太大就要考慮是否是實驗過程中的誤差. 我曾經看到園子的有些帖子報道說OD值大概在0.2-1.2范圍內與活細胞數有較好的線性關系，但OD值在0.3-0.9范圍內可能更佳，若你的OD值不在這個范圍內則你實驗的細胞數可能不太合適，應調整你的細胞數。邊緣效應96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不養細胞，否則這四行的數據會偏高或偏低,96孔板在培養箱中，由于濕度不夠，而培養箱由于具有一定的溫度，由于溫度梯度使得邊緣的孔水分蒸發較快，導致培養基中各種成分濃度變化增大，導致細胞狀態不同。對于這種現象，要保證培養箱中的濕度，減少開關培養箱的次

27、數和時間。解決方法:將孔板周圍的一圈孔全部不用，影響非常大，而且最外一圈一定要加水、PBS或者培養液，只要能防止蒸發就可以.關于如何計算IC50(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應率之和Pm:最大陽性反應率Pn:最小陽性反應率舉個例子：各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入計算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0

28、.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025(2)Bliss法:自己查閱書籍(3)IC50計算軟件，見下面附件（4）自己用EXCEL做趨勢線來求IC50，關于LD50的方法與此相似！（5）在線求IC50或EC50：http:/chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm結果統計學處理所有數值以x±s表示，應用SPSS軟件進行方差分析，p<0.05時為相差顯著，p<0.

29、01時為相差非常顯著。可以以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生線，專門公式求IC50。或計算抑制率。細胞死亡率%=OD對照組-OD實驗組/OD對照組excel表中可以做兩兩比較的T-test,這個你可以參考一下；你的數據應該用多個樣本均數的T-test，方差分析也可。用的軟件是SPSS或者SAS。孔板的重復利用:培養板要用好的（最好進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。一般貼壁生長的細胞用重復利用的培養板效果不是很好，因為培養板表層在生產時涂有一層促進細胞貼壁的物質，在清洗后多半會失去。懸浮或是半懸浮生長的細胞還可以。建議不要用太多次，即使是進口的板子使用次數也不要超過3次,底值最好在測得值的1/3一下。強烈建議培養板不要重復使用:1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于細胞的生長，會出現帖壁不好，細胞生長緩慢等情況.2、這樣的板子消毒滅菌很不徹底，如果有萬一,則因小失大.3、重復用的板子洗不干凈在培養過程中易出現雜質.重