1、食品沙門氏菌檢測方法進展(一)    沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學上具有重要意義的人畜共患病之一，其病原沙門氏菌屬腸道細菌科，包括那些引起食物中毒，導致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細菌。它們除可感染人外，還可感染很多動物包括哺乳類、鳥、爬行類、魚、兩棲類及昆蟲。人畜感染后可呈無癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動物的繁殖生產(chǎn)力。 蛋、家禽和肉類產(chǎn)品是沙門氏菌病的主要傳播媒介，感染主要取決于沙門氏菌的血清型和食用者的身體狀況，受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個體。根據(jù)國際慣例，要求對易受沙門氏菌污染的食品進行分類管理，以

2、使大多數(shù)食物不含沙門氏菌，從而有效預防沙門氏菌病。為此，人們在探索沙門氏菌檢測方法的過程中，作出了不懈的努力，現(xiàn)將有關進展報告如下，并介紹兩種快速檢測沙門氏菌的試劑盒。 自19世紀后期，沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來，檢測方法學都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門氏菌的方法實質上與那些用于臨床病料的方法是相同的。但至少有三個因素限制了用于臨床病料的方法應用在食品分析上。第一，通常，沙門氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質會干擾病原的檢測，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個很高的水平，從而影

3、響特定細菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經(jīng)過加工的食品，由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的沙門氏菌受到了尚不致命的損傷或稱“致傷”。這就形成了一個具有不同生長特性的細菌群。這種現(xiàn)象對那些希望從食物樣品中分離出沙門氏菌的食品分析家來說有很大影響，因為在選擇培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)“致傷”的沙門氏菌通常是以細菌死亡和試驗失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡單的微生物增殖步驟，專門針對以食品為傳播載體的病原。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費力、耗時，需要47天才能完成。因此，在需要及時、快速評價食品中微生物的安全性時，通常不被采用。隨著DNA和抗體技術的發(fā)展

4、，近1015年間發(fā)展了無數(shù)改進的方法，其中許多可以在48h內(nèi)檢出沙門氏菌，這些方法通稱為快速檢測。 1傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法 用于沙門氏菌分析的傳統(tǒng)方法是食物樣品分步增菌，以增加病原的可檢出率，這種培養(yǎng)方法總體可分4個不同階段或步驟。第一步(預增菌)，將樣品加到一種高營養(yǎng)、無選擇性的培養(yǎng)基中，溫度37，使那些“致傷”的細菌復蘇及使所有微生物生長。雖然緩沖胨水被建議常規(guī)使用(由于其可保持溶液pH值穩(wěn)定)，但對培養(yǎng)基的選擇仍存有爭論。第二，是選擇性增菌步驟，它使沙門氏菌生長而使肉湯中同時存在的微生物數(shù)量減少，與預增菌培養(yǎng)基相似，對選擇性培養(yǎng)基的選擇，也存在許多不同的觀點。目前應用的主要有如下3種類型：連四

5、硫基鹽肉湯(Tetrathionate broth)、硒酸鹽胱氨酸肉湯(Selenite cystine broth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培養(yǎng)基。由于沒有任何一種培養(yǎng)基可以全面地保持所有食品基質或各種沙門氏菌血清型，所以，較適當?shù)淖龇ň褪鞘褂脙煞N培養(yǎng)基平行地進行試驗。第三步是分離步驟，即選擇性培養(yǎng)物在含一種或多種抑制非沙門氏菌生長制劑的瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，然后對平板上肉眼可見的特征性菌落進行確認，并對該菌落分離物進行一系列生化和血清學檢測，以作出鑒定。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測法全過程需時至少47天，才能得出明確的診斷結果。 2以抗體為基礎的檢測方法 利用抗原-抗體反應的

6、顯著特異性，來進行細菌的鑒別和血清學定型，已有半個多世紀的歷史。細菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來檢測以食品為載體的病原。已經(jīng)建立的沙門氏菌免疫學檢測方法有許多種，大致可分為以酶標抗體(ELISA)，熒光抗體染色(免疫熒光法)，同位素標記抗體(放射免疫試驗)為基礎的方法及其它多種以抗體為基礎，利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴散及免疫色譜技術的方法。但常規(guī)中最廣泛采用的是以雙位點ELISA技術即夾心ELISA為基礎的方法。此法改進后用有放射活性的同位素替代標記抗體，概括地說，是指以固定在固體基質上的“捕捉”抗體來捕捉目標抗原，經(jīng)洗滌除去未結合的成分，加入第二種酶

7、標抗體，此者結合在捕捉到的抗原的不同位點上，第二次洗滌后加入酶作用基質，并令其與顏色成分反應，然后用分光光度法即很容易檢 測到目標抗原。采用微量滴定板作為固態(tài)基質使反應形式標準化，并促成其自動化。 最近黎兆滾等人首次在國內(nèi)口岸系統(tǒng)應用微量板ELISA法(Salmonelle test 1)對進出口動物產(chǎn)品(魚粉、肉骨粉等)進行沙門氏菌檢測。該法采用預先包被了沙門氏菌(A-E群)單克隆抗體的微量板，加入經(jīng)增菌處理的樣品，反應后再加入一定的指示劑，作用畢后用酶標儀測定OD值來判定結果。食物樣品經(jīng)適當?shù)脑鼍幚恚部捎么朔ㄟM行沙門氏菌檢測。 ELISA法檢出沙門氏菌的極限范圍在105106個細胞/m

8、l，因此，要得出可靠的結果，食物樣品首先必需進行預增菌、選擇性增菌，通常還要在含有D-甘露糖的肉湯(M肉湯)中進行后增菌，以促進鞭毛發(fā)育。總的來說，標準的ELISA法樣品的制備，約需要經(jīng)過4048h的孵育才能完成。黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)樣品制備過程分三步，共耗時24h：選用營養(yǎng)肉湯進行預增菌(6h)，使“致傷”、冷凍的沙門氏菌復蘇。使用選擇性培養(yǎng)基RV進行增菌(14h)，使沙門氏菌大量繁殖，同時抑制其它雜菌生長。使用營養(yǎng)肉湯(蛋白胨水)進行后增菌(4h)，使沙門氏菌的數(shù)量大大增加。比上述標準的ELISA法樣品制備過程縮短了一半的時間。ELISA方法

9、本身，則僅需要大約2h而已(其中30min是操作時間，90min是孵育時間)。相比之下，黎兆滾等人的方法可在27h內(nèi)完成，比上述方法縮短了一半的時間，頗值得推廣應用。 最新式的沙門氏菌免疫學檢測法，利用經(jīng)特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎。幾滴樣品加到卡片上，結果可以直接用肉眼讀出。免疫色譜卡片極易操作，且由于無需要特殊設備，很適合小型實驗室使用。盡管卡片檢測法與ELISA法一樣需要對樣品進行增菌處理，但它(卡片法)本身通常需時不超過10min，如果采用黎兆滾等人的樣品制備法，則可使操作時間更為縮短。 3以核酸為基礎的方法 細胞核酸DNA和RNA是唯一一類可以攜帶信息的大分子。由于所有的細胞都

10、含有這種分子，可以利用它作為檢測的標靶。標靶通常是一個特異性核酸序列，它可通過以補體核酸分子作為探針來檢出。與免疫學方法相似，探針也需要加附適當?shù)臉擞洠绶派湫酝凰亍⒚富虬l(fā)光的標識物。Fitts等人在食品沙門氏菌檢測中引入了第一代DANRNA雜交技術，此法應用的探針含有用放射性同位素標記的傷寒沙門氏菌DNA片段，其敏感性高，經(jīng)大約48h的增菌步驟后，檢測極限可達108個細菌/ml，但由于要使用放射性同位素，只能在專門的實驗室應用，此方法的優(yōu)點都被抵消了。為此，以核酸雜交為基礎的第二代技術比色計目前已發(fā)展起來。這種方法依賴于沙門氏菌核糖體RNA(rRNA)核糖體發(fā)育過程中儲存的核酸成分的檢測。

11、核糖體是細胞蛋白質合成器的一部分，每個細菌細胞中存在500020 000個復制體，而相比之下染色體DNA復制體僅210個。這種天然富含rRNA標靶序列的情況使得用無輻射計檢測成為可能，同時又保持了與放射性同位素方法相當或更高的敏感性。其另一優(yōu)點是由于rRNA為單鏈(而DNA為雙鏈)，雜交前無需經(jīng)過變性步驟。要得到陽性結果，此法需要105個靶細胞/ml，因此對沙門氏菌檢測來說，需要進行預增菌和選擇性增菌，總共約50h。rRNA探針法比沙門氏菌ELISA法更耗時，但二者成本相近。 食品細菌檢測法的最新進展是在化學擴增體系方面的發(fā)展，即聚合酶鏈反應(PCR)，用該體系可對制備好的樣品進行細菌DNA擴

12、增，以便更易于用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測。用于檢測沙門氏菌和其它以食物為載體的病原的PCR方法業(yè)已建立，其中一些方法顯示了極好的敏感性。但該法較難自動化，且必需經(jīng)選擇性增菌以稀釋可能干擾檢測反應的某些成分。一個完整的以PCR為基礎的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵銷了其高敏感性的優(yōu)點，但這種方法對那些含沙門氏菌較少或沙門氏菌“致傷”嚴重難以復蘇而仍保有沙門氏菌rRNA的樣品尤其有效。 盡管目前用來檢測沙門氏菌的方法各有優(yōu)缺點，但隨著科學發(fā)展，技術進步，人們探索、實踐的繼續(xù)深入，我們可以期待，將會有更多，敏感性更高，特異性更強，診斷時間更短的新方法出現(xiàn)。 4兩種沙門氏菌快速檢測

13、法 4.1Transia沙門氏菌平板檢測法與耗時、昂貴的傳統(tǒng)方法相比，此法快12天，且每次檢測所需的操作時間縮短。該法建立在夾心ELISA法的基礎上，利用多抗體混合物以保證檢出所有的沙門氏菌血清型。反應的固相載體是一種有可見或不可見條紋的微量反應板。其小孔內(nèi)包被有沙門氏菌的特異性單克隆抗體。 第一階段，在小孔內(nèi)加入樣品和抗體聯(lián)合物(沙門氏菌屬特異性單克隆和多克隆抗體的混合物)。孵育期間，沙門氏菌抗原和包被抗體形成了一種復合物：包被單克隆抗體-沙門氏菌抗原-抗體聯(lián)合物。洗滌后，通過每孔加入基質溶液(過氧化脲)和色素原溶液(四甲基氨基丙苯)來顯示上述復合物；酶催化色素原的氧化，結果產(chǎn)生藍色。加入反

14、應終止液終止催化反應，并使反應混合物酸化，顏色由藍變黃。 這種ELISA方法可對經(jīng)選擇性增菌及熱休克作用后，釋放了特異性沙門氏菌抗原的食品和環(huán)境樣品進行檢測。如采用黎兆滾等人的樣品制備法，可大大縮短檢測時間；此法可在沒有酶標儀的實驗室進行，從這點來說，Transia沙門氏菌平板檢測法比黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)更適應于一般的實驗室使用。 4.2Transia沙門氏菌卡片檢測法此法以單步免疫反應即夾心型免疫色譜反應為基礎。反應固相包括一塊用“抗沙門氏菌抗體-染料”偶合物浸透的染料襯墊和一張薄膜條，抗沙門氏菌抗體就固定在薄膜的反應區(qū)上。增菌后，增菌肉湯用移液管加到樣品小孔內(nèi)并令其吸收，如樣品存在沙門氏菌抗原，它們會與偶合物作用，然后依次遷移到膜上，與固定在膜上反應區(qū)