1、米帕明對谷氨酸損傷中樞神經細胞的保護作用(1)                               作者：許勇 姬汴生 石樂鳴 劉紅 張貴卿  【關鍵詞】  米帕     【摘要】    目的 

2、0;  研究米帕明(Imi)對谷氨酸損傷培養大鼠皮層神經細胞的保護作用。方法    分離培養15胎齡的大鼠神經細胞，加入谷氨酸(Glu)，觀察谷氨酸對神經細胞的損傷作用及米帕明的保護作用。結果    加入谷氨酸后，神經細胞出現明顯損傷性變化，死亡率升高，培養上清液中乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)含量增加，細胞勻漿中丙二醛(MDA)生成增加，超氧化物歧化酶(SOD)含量明顯減少。Imi能不同程度地減輕上述損傷性變化。結論    I對谷氨酸所致的神經細胞損傷具有保護作用，其作用機制可能與鈣拮

3、抗作用有關。     【關鍵詞】    米帕明；谷氨酸；大腦皮層神經細胞；細胞培養     【bstract】    Objective    To study the protective effects of imipramine (Imi) on glutamate-induced neurotoxicity in cultured rat cerebral cortical neurons.ethods   

4、 Cortical neurons of fetal of rat were cultured in vitro.The protective effects of Imi  on glutamate-induced neurotoxicity were  obserced.esults    Exposure of rat fetus cerebral cells to Glu medium developed a neurotoxicity expressed in the increase of LDH leakage and NO,MD

5、A content and the decrease of activity of SOD,as well as the development of morphological injury.Imi protected neurons against above damage significantly.onclusion    The results suggest that Imi prevents the toxicity of Glu.And it maybe attribute to its effect of anticalcium.  &

6、#160;  【ey words】    imipramine,glutamate,cerebral cortical neurons,cell culture     缺血性腦血管病是臨床常見疾病，對其發病機制人們提出了多種學說，如鈣超載學說、興奮毒性學說、自由基學說等，其中興奮毒性學說早已為人們所重視。谷氨酸(glutamate,Glu)是中樞神經系統內含量最高的興奮性氨基酸，而幾乎所有的神經細胞都有谷氨酸受體，因此任何引起胞外谷氨酸濃度異常增高的病理變化均會產生興奮毒性。有研究發現，米帕明(，）具有鈣拮抗作用，對兔基底

7、動脈有選擇性舒張作用，因此考慮該藥可能有腦保護作用。本研究利用培養大鼠皮層神經細胞，建立谷氨酸損傷模型，觀察谷氨酸對神經細胞的損傷作用及研究I是否具有保護作用，并探討其可能的作用機制。         材料與方法         材料    Wistar大鼠，孕15，由河南省實驗動物中心提供。鹽酸米帕明、多聚-賴氨酸(相對分子量為150 000 ）、谷氨酸、噻唑蘭（MTT)均為Sigma公司產品；DMEM高糖培養基、胎牛血清、馬血清均為Gibco

8、公司產品；鹽酸阿糖胞苷為上海華聯制藥有限公司產品，批號990901；乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均為南京建成生物工程研究產品；總蛋白試劑盒為北京中生生物工程高技術公司產品。其余試劑均為市售分析純。HERA cell二氧化碳培養箱(德國GmbH公司)；SW-型凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司）；BH-型倒置顯微鏡(日本Olympus Optical公司)；722型分光光度計(上海第三分析儀器廠)；DG5031型酶聯免疫檢測儀(華東電子管廠)。         方法 

9、0;       胚胎大鼠大腦皮質神經細胞培養：孕15 istar大鼠腹腔注射水合氯醛350麻醉，無菌條件下剖腹取出胎鼠，開顱取出大腦皮層放入預冷的DMEM培養基中，剔除軟腦膜和血管，將腦組織移入含血清的DMEM培養基(含10%胎牛血清和10%馬血清)的小燒杯中，用細口吸管反復輕輕吹打成細胞懸液，以200目不銹鋼篩網過濾，并將濾液細胞數調至1×個，接種于經0.01%多聚-賴氨酸過夜處理的細胞培養板中(24孔板接種1孔，96孔板接種0.1孔)，置37、CO培養箱中培養。次日待細胞貼壁后換液1次并去除死細胞，以后每3 d換液1次。細胞培養

10、至第6天時，加入終濃度10阿糖胞苷以抑制非神經細胞的生長，18后換新的DMEM培養基繼續培養。         Glu對神經細胞的損傷，：取培養12的神經細胞，吸去原培養液，用無arlie液(-）：aCl 143，l .，.，.，葡萄糖5.6，.，.洗2遍，每孔加入含Glu終濃度5×的無Marlie液1(24孔板)、.（孔板)，15后用DMEM培養基洗去Glu,再換用無血清的DMEM培養基，置37、培養箱中繼續培養24。正常對照組不加G，其余處理同上。給藥組在損傷處理前24及處理過程中均加入不同濃度的I。  

11、60;      MTT微量自動比色：lu損傷細胞后24，用MTT染色法測定細胞存活率。96孔細胞培養板于終止培養前每孔加入10 （終濃度為0.5L)，繼續培養4 h后，吸去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）100溶解甲肷結晶，待其充分溶解后，用酶標儀測其OD值，檢測波長為570。細胞存活率(%)=值/對照組OD值×100%。         LDH和NO的測定：細胞經損傷處理后，收集培養上清液，按文獻方法，參照試劑盒說明書測定培養液中LDH活性、NO含量。   &

12、#160;     神經細胞SOD和MDA的測定：細胞經損傷處理后，去除原培養液，用PBS洗2遍，每孔加入0.1LPBS和.( .），再加入50 1%Triton-100，將24孔培養板置振蕩器振蕩1 使細胞溶解，加入100H3PO4以沉淀蛋白，100 000×于4離心1，取上清液，按試劑盒說明書測定SOD活力和MDA含量。蛋白質定量用雙縮脲法。     表1    米帕明對Glu引起的神經（略）     表2    米帕明對Glu損傷

13、神經細胞（略）         討論     Glu是中樞神經系統內含量最高的興奮性氨基酸，在維持神經細胞正常信號傳導中起著重要的作用。但Glu大量釋放，激活G受體，繼而引起一系列病理反應，導致神經細胞變性壞死。研究表明，腦缺血時細胞膜通透性增高，G釋放增加、攝取減少，G濃度升高，過量G作用于NMDA受體使之門控的離子通道開放，引起K大量外流，C、內流，胞內鈣超載。細胞內C濃度升高是神經元損傷的機制之一，其后果是多方面的，除可激活一系列C依賴性酶，包括蛋白激酶C(PKC)、一氧化氮合酶(NOS)、核酸內切

14、酶(endonuclease)、磷脂酶A2(PLA2)等，觸發花生四烯酸代謝瀑布、黃嘌呤氧化酶系活化產生自由基，造成細胞損害外，尚可由激活NOS引起NO的繼發性損傷。神經細胞和膠質細胞的細胞膜上存在谷氨酸胱氨酸轉運體(glutamate/cystine transporter,又稱Xc antiporter system)，其作用是將胞內Clu轉運出胞，同時將胱氨酸胞外轉運入胞。胱氨酸在胞內還原為半胱氨酸(Cys)，后者是谷胱甘肽(GSH)的合成原料，也是其合成的限速因素。當細胞外Glu過多時可抑制谷氨酸胱氨酸轉運體的功能，使胱氨酸入胞減少，GSH合成減少。GSH是腦內重要的活性氧清除劑，故胞

15、外Glu過多使細胞內氧自由基(OFR)堆積，從而對細胞產生毒性作用。OFR可以抑制Glu載體的功能，加劇胞外Glu堆積，增強Glu的毒性作用，使活性氧成分更趨增多，形成惡性循環。本實驗顯示，培養的神經細胞受到Glu損傷后，細胞死亡率、LDH漏出率升高，NO和膜脂質過氧化產物MDA生成增多，SOD活性下降。Imi能減少NO、生成，降低LDH漏出率和細胞死亡率，提高SOD活性，表現出較強的腦保護作用。神經細胞缺血性損傷與C信號轉導異常導致胞內C濃度升高密切相關，細胞C信號轉導異常是神經細胞變性的“最后共同通道”。興奮性氨基酸對神經細胞的損傷作用總是伴隨著鈣超載現象。因此我們認為I對Glu引起的大鼠

16、神經細胞損傷的保護作用可能與其鈣拮抗作用有關。     參    考    文    獻     宋秀媛，可君，張貴卿，等米帕明對兔離體基底動脈的作用中國藥理學報，1992，（）：     Dildy J,Leslie SW.Ethanol inhibits NMDA-induced increase in free intracellular Cain dissociated brain cellsBrain Re

17、s,1999,499：     oh JY,Goldberg MP,Hartley DM,et al.Non- receptor mediated neurotoxicity in cortical culture Neurosci,1993,13(5):496     amura Y,Sato Y,Yokota T,et al.If enprodil prevents glutamate cytotoxicity via polyamine modulatory sites of N-spartate receptors in cu

18、ltued cortical neurons Pharmacol Exp Ther,1993，265(2):1017     孫東旭，張莉，陳學清體外細胞增殖和細胞毒試驗見：朱立平，陳學清主編免疫學常用實驗方法北京：人民軍醫出版社，2000     olh JY,Choi DW.Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in culture by lactate dehydrogenase efflux assayJ Neurosci Med,1987，5(5):83     eller JN,Kindy MS,Holtsberg FW,et al.Mitochondrial manganese superoxide dismutase prevents neural apoptosis and reduces ischemic brain injury:suppression of peroxynitrite production,lipid peroxidation,and mitochondrial dysfunctionNeurosci,1998，18(2):687 &