1、精選優質文檔-傾情為你奉上生產白蛋白的工藝技術閆朗 天津生物工程職業技術學院 08生物3班摘要：白蛋白有維持血漿膠體滲透壓的功能，以廣泛地應用于失血性休克、嚴重燒傷、低蛋白血癥的臨床治療。那么本文就以白蛋白的結構和性質、功能、白蛋白的生產原料、生產試劑、生產器材、白蛋白的生產工藝路線、白蛋白生產的具體操作步驟、白蛋白檢驗的方法等方面來闡明白蛋白從無到有的全過程并表達本人對此過程的一些不成熟的觀點和結論。關鍵詞：白蛋白，提取，鹽析、沉淀、熱處理前言：白蛋白是由人類血漿提取的一類血液制劑藥品，是現代醫學用于預防和治療不可缺少的藥品，它是一類特殊的藥品，其唯一原料是人血，一方面受社會，經濟和政治因素

2、的制約，不能隨意開發，另一方面是維持生命的重要物質，它又不可缺少。人血白蛋白在臨床上是急需補充營養和蛋白質的多種重癥疾病患者不可缺少的治療劑，是醫院臨床急救或重癥手術的必備藥品，使用量很大。除臨床需求外白蛋白作為生產疫苗的培養基成分和保護劑的市場也十分可觀。另外，還有許多生物藥的生產過程和最終產品中都需要白蛋白做保護劑。從各個方面來說，加快我國白蛋白的研制和生產已是勢在必行。1 白蛋白結構、性質、功能 白蛋白又稱清蛋白，是人血漿中含量最多的蛋白質，約占血漿總蛋白的35%。【1】人白蛋白對人體無抗原性。白蛋白是由肝實質細胞合成，在血漿中的半壽期約為15-19天，其合成率雖然受食物中蛋白質含量的影

3、響，但主要受血漿中白蛋白水平調節，在肝細胞中沒有儲存，在所有細胞外液中都含有微量的白蛋白。關于白蛋白在腎小球中的濾過情況，一般認為在正常情況下其量甚微，約為血漿中白蛋白的0.04%，按此計算每天從腎小球濾過液中排出的白蛋白即可達3.6g，為尿中蛋白質排出量的30-40倍，可見濾過液中多數白蛋白是可被腎小管重新吸收的。有實驗證實白蛋白在近曲小管中吸收，在小管細胞中被溶酶體中的水解酶降解為小分子片段而進入血循環。白蛋白可以在不同組織中被細胞內吞而攝取，其氨基酸可被用為組織修補。白蛋白相對分子質量較小。白蛋白為單鏈，含575個氨基酸殘基，相對分子質量為65000，其N末端為天冬氨酸，C末端為亮氨酸，

4、PI為4.7?！?】可溶于水、稀酸、稀堿、稀鹽和半飽和的硫酸銨溶液中，沉降系數（S20W）為4.6，電泳遷移率為5.92。一般在60%的硫酸銨飽和度時析出沉淀【1】。對酸較穩定。受熱后可聚合變性，但仍較其他血漿蛋白質耐熱，蛋白質的濃度大時熱穩定性小。氯化鈉或脂肪酸鹽可提高白蛋白的熱穩定性?！?】利用這種性質，可使白蛋白與其他蛋白質分離。主要功能是維持血漿膠體滲透壓。白蛋白是血漿中含量最多、分子最小、溶解度大、功能較多的一種蛋白質。血漿膠體滲透壓的維持主要依靠血漿中的白蛋白，膠體滲透壓是使靜脈端組織間液重返回血管內的主要動力。當血漿白蛋白因病理條件引起下降時，血漿的膠體滲透壓也隨之下降，可導致血

5、液中的水份過多進入組織液而出現水腫。白蛋白損失它多會引起血量減少，是早產出血性休克的主要原因。血漿白蛋白有運輸功能，血漿白蛋白能與體內許多難溶性的小分子有機物和無機離子可逆地結合形成易溶性的復合物，成為這些物質在血液循環中的運輸形式。由此可見白蛋白屬于非專一性的運輸蛋白，在生理上具有重要性，與人體的健康密切相關。血漿白蛋白在臨床上用于失血性休克以及由腦水腫或大腦損傷所致的腦顱壓增高，嚴重燒傷，低蛋白血癥的治療;尿白蛋白可作為臨床診斷用酶的保護劑、尿激酶標準品中的保護劑、測定蛋白質相對分子質量用的標準蛋白等，是一種廉價而易得的人血白蛋白的代用品。目前從人血漿中分離的白蛋白有兩種制品：一種是從健康

6、人血漿中分離制得的，稱人血白蛋白;另一種是從健康產婦胎盤血中分離制得，稱胎盤血白蛋白。從動物血漿制備的白蛋白，稱動物血白蛋白。從男性尿液中制備的白蛋白，稱尿液白蛋白。白蛋白制劑為淡黃色略稠的澄明液體或白色疏松狀（凍干）固體?！?】2 生產白蛋白的原料、試劑、器材2.1原料選用新鮮干凈的人胎盤，健康成人的血液，健康成人男性的尿液，三者均可。2.2試劑鹽酸：這里用來調節PH，選用化學純試劑。氫氧化鈉：這里用來調節PH，選用化學純試劑。硫酸銨：這里作為沉淀劑，選用化學純試劑。碳酸鈉：這里用來調節溶液的PH，選用化學純試劑。利凡諾：這里作為沉淀劑，選用化學純試劑。氯化鈉：這里用于鹽析，選用化學純試劑。

7、硝酸銀：這里作為鑒定試劑，選用分析純試劑。氫氧化鋁：這里作為吸附劑，選用分析純試劑。活性炭：這里用來調節PH，選用藥用活性炭。D-160樹脂：一種大孔徑陽離子交換樹脂，用于吸附白蛋白。DEAE-纖維素：是一種陰離子交換纖維素，主要用于中型或酸性蛋白的分離。白蛋白的等電點為4.7，因此在高于白蛋白的等電點時，DEAE-纖維素即可吸附帶負電荷的白蛋白。這里用于分離純化白蛋白。磷酸：這里作為溶劑，選用化學純試劑。EDTA（二乙胺四乙酸）：這里作為穩定劑，選用化學純試劑。0.05mol/L PH=5.2的乙酸-乙酸鈉：這里作為緩沖液，選用化學純試劑。檸檬酸三鈉：這里作為抗凝劑，選用化學純試劑。聚乙二醇

8、：這里作為致孔劑，選用化學純試劑。2.3器材不銹鋼夾層反應罐、不銹鋼夾層反應鍋、搪瓷缸、不銹鋼桶（50L）、冷凍干燥機、酸度計、尼龍布、溫度計（1-1000c）?！?】3 生產白蛋白的工藝路線選用新鮮干凈的人胎盤在潔凈度為十萬級的區域進行預處理制成胎盤漿使胎盤漿能夠合并，在潔凈度萬級的區域用低溫氯化鈉溶液提取胎盤漿中的液體，用硫酸銨鹽析出沉淀，沉淀是用來制備免疫球蛋白的原料，而鹽析出的濾液用鹽酸沉淀后棄去濾液，而沉淀物經超濾后，將濾液在潔凈度為十萬級的區域中進行病毒滅活，也就是熱處理收集濾液，轉入潔凈度為百級的區域中進行二次鹽析棄去濾液，收集鹽析物進行二次超濾，收集超濾液吸附除雜，后處理，在潔

9、凈度為十萬級的區域中進行分裝，用于分裝的內包裝材料要先粗洗，再到潔凈度為十萬級的區域中進行精細與滅菌除熱原。然后才可分裝和包裝全檢后入庫。4 生產白蛋白具體操作步驟及生產質量要點4.1生產白蛋白具體操作步驟4.1.1預處理將冷凍的健康人胎盤，用無菌的剪刀剪去并擠出臍帶血，將胎盤剪成適當碎塊，放入滅菌的絞肉機中絞碎，制成胎盤漿。4.1.2提取將制好的胎盤漿放入不銹鋼鍋中，按每個胎盤加1L無熱原的40g/L（4%）氯化鈉溶液（內含0.5%苯酚），浸漬提取一小時，然后用紗布過濾，收集濾液。剩下的固體雜質用500ml無熱原的40g/L（4%）氯化鈉溶液（內含0.5%苯酚），浸漬提取一小時，然后用紗布過

10、濾，剩下的固體雜質用250ml無熱原的40g/L（4%）氯化鈉溶液（內含0.5%苯酚），浸漬提取一小時，然后用紗布過濾，收集三次的濾液，調試離心機的轉速為2000r/min,除去濾液中的紅細胞，得到提取液。4.1.3鹽析 將以上經離心后的胎盤提取液傾入搪瓷缸中，在攪拌下加入等體積飽和硫酸銨溶液，然后放置一小時以上，使球蛋白沉淀析出，用尼龍布自然過濾，收集濾液。沉淀是生產免疫球蛋白的原料。4.1.4沉淀 將以上濾液傾倒在不銹鋼桶中，用1mol/L鹽酸調節PH至4.3-4.4，放置一小時后，然后用尼龍布自然過濾，收集沉淀物。4.1.5超濾 將以上沉淀物溶解于5-10倍的蒸餾水中，然后用超濾器過濾，

11、注意過濾所使用的濾膜為分子量30000的超濾膜，直至硫酸銨含量低于2g/L(0.2%)時為止，收集超濾液?！?】4.1.6熱處理將以上收集的超濾液倒入不銹鋼桶中，加入適量的氯化鈉使之溶解，使氯化鈉濃度達8.5g/L（0.85%），用尼龍布自然過濾，全部過濾完之后測定濾液的蛋白質含量，再加入無熱原水稀釋蛋白質濃度至12-20g/L(1.2%-2%)。然后按2g/L(0.2%)的量加入固體辛酸鈉，用1mol/L鹽酸調節PH至5-5.2，攪拌溶解后在0-5oc的條件下放置一個晚上。次日將溶液倒入反應鍋中，再重新調節PH至5-5.2，然后將其加熱，當加熱至67OC時加入2g/L(0.2%)活性炭，攪拌

12、15min,加溫至69oc后保溫一小時冷卻至45oc以下，也可以是60oc保溫十小時，用帆布自然過濾收集濾液。4.1.7二次鹽析 將以上濾液按照1g的體積的四十倍加入氯化鈉化學純試劑或加入硫酸銨，使硫酸銨的質量濃度達到178g/L,以1mol/L鹽酸調節PH調節至3.75-3.85，放置一小時后，用帆布自然過濾壓干收集沉淀物。4.1.8二次超濾 將以上沉淀物先加入適量的0.5mol/L的氫氧化鈉充分攪拌調成漿糊狀，再加入適量的1mol/L的氫氧化鈉充分攪拌調成漿糊狀，最后加入適量的2mol/L的氫氧化鈉充分攪拌調成漿糊狀，然后再加入5-10倍的無熱原水，并調節PH至7.8-8，用截留分子量為3

13、0000的超濾膜超濾透，直到用硝酸銀試劑檢查氯離子不高于自來水的空白對照時為止，收集超濾液?！?】4.1.9吸附除雜 將以上超濾液倒入不銹鋼桶中，加入吸附劑，吸附劑為2-4g/L(0.2%-0.4%)氫氧化鋁或20-30g/L(2%-3%)活性炭，進行攪拌吸附一小時，然后用尼龍布自然過濾收集濾液。4.1.10后處理將以上濾液調節PH至6.6-7，將蛋白質稀釋至100g/L(10%)或250g/L(25%)，除菌過濾取樣進行藥品的質量檢查，合格后制成凍干制品。4.2白蛋白的生產管理、質量控制的要點、樣品儲存、運輸4.2.1生產管理的要點生產時所使用的器具無論是直接用于生產的金屬或玻璃等器具，還是

14、間接用于生產的金屬或玻璃等器具都必須經過嚴格清洗消毒滅菌處理后專用。原料健康人胎盤的采集和質量應符合原料人胎盤采集規程要求。健康人胎盤的采集應盡可能保持無菌，并在八小時內冰凍至-20 OC至以下，原料檢定合格后就可以及時投料制造，也可以置于-20oc以下冰凍保存，但保存期不得超過2年。蛋白質的透析與濃縮都應采用超濾法。在澄清和除菌過濾時應使用尼龍布和紗布，這種無石棉的介質。病毒滅活時應保證每批產品均經過60+0.5oc至少十小時的連續加溫，這樣才能滅活可能殘留的污染病毒。分裝與凍干必須在嚴格的無菌條件下進行。凍干制品分裝后應及時冷凍，采用適宜條件進行凍干，凍干過程制品溫度不得超過50oc,真空

15、封口?！?】4.2.2質量控制要點 原料及輔料應符合中華人民共和國藥典或中國生物制品主要原輔料材料質量標準的要求。生產用水應符合飲用水標準，純化水、注射用水和滅菌注射用水應符合中華人民共和國藥典的要求。原料健康人的胎盤血應進行HbsAg、HIV-1/HIV-2抗體、HCV抗體、梅毒檢查，均為陰性。原料應按照規程要求進行殘留乙醇含量、蛋白質含量、純度、PH值、熱原試驗，項目的檢測。半成品立即分裝時可在除菌后留樣做無菌檢查。每批成品應按規程要求抽樣做全面檢定，所用的HbsAg、HIV-1/HIV-2抗體、HCV抗體等檢測試劑盒應經國家藥品監督管理局批準?！?】4.2.3白蛋白的儲存 白蛋白的正確保

16、存極為重要，一旦處理不當，辛辛苦苦生產的白蛋白成品就會失活、變性、變質，使前面的全部制備工作化為烏有，損失慘重。要想從溶液中除去多余水分，采用的方法是在常溫或高溫條件下進行蒸發，但這樣會使生物活性物質加速被破壞，并且改變了這些物質的溶解度，所以不宜采用。要想在干燥過程中最大限度地減少生物活性物質被破壞，唯一的方法就是使溶液在低溫下干燥。但是，溫度的降低不但會使溶液凝固，還會使水的蒸氣壓力降低從而難以揮發，這就需要大大降低氣壓使固態的水直接升華成為水蒸氣。凍干技術就是在這一理論基礎上產生的。凍干技術是先將生物大分子溶液中的水凍成冰，然后在低溫和高真空的條件下使冰升華，成為固體干粉。當白蛋白溶液冷

17、卻至冰點時，純水首先結冰形成初結晶。初結晶過程中若白蛋白所處的溫度低，熱交換速度大時，溫度下降可達每秒50oc或更高，這種冷凍方法叫速凍。反之，當白蛋白所處的溫度高，熱交換速度小時，這種冷凍方法叫慢凍。由于冷凍速度不同，冷凍過程中所形成的結晶大小也不同。慢凍可使白蛋白形成大的結晶，使白蛋白中的活性物質分子受到應力。另外，慢凍延長了共溶混合物中鹽對生物活性物質的作用時間，增加了分子聚合的機會，導致白蛋白變性。所以白蛋白一般采用速凍。當白蛋白的溫度降低為共熔點時，溶質和溶劑將同時凍結形成二次結晶，此時若能加快熱交換速度或設法阻止結晶形成而使混合物以無定性狀態凝固，則可減少生物活性物質的變性破壞。在

18、略高于或略低于共熔點的溫度下冷凍白蛋白，其變性的程度最小，這可能是冷凍溫度越來越接近共熔點，白蛋白越有可能形成無定性狀態的緣故。 在白蛋白溶液中，水以游離水、中間型結合水和結構性結合水三種狀態存在。第一次干燥的目的主要是除去大量的游離水和部分中間型結合水。在操作過程中，壓力通常要求降至0.5-0.1mmHg,因為水蒸氣的壓力為4mmHg,氣壓必須大大低于此值，才能使冰塊比較快地升華。第一次干燥時，加熱溫度要嚴格控制，避免凍干物質的溫度高于共熔點，否則，白蛋白將溶解產生氣泡，導致白蛋白變性。第一次干燥后，殘余水分為1%-4%。如果白蛋白在這種含濕量下能保持穩定，就能夠停止凍干，封口保存。否則，需

19、要進行第二次干燥。 第二次干燥的目的主要是除去殘留的中間型結合水，但應注意不要使結構型結合水除去，否則將導致白蛋白的氧化，甚至會破壞白蛋白的高級結構，使其變性失活。通過凍干得到白蛋白固體樣品有許多優點：一個是由固態直接升華為氣態，所以樣品不起泡不報沸。一個是得到的干粉樣品不黏壁易取出。一個是凍干后的樣品是疏松的粉末，易溶于水。一個是在低溫低壓的條件下干燥，白蛋白不容易氧化變質，同時壓力低使得空氣稀薄有滅菌或抑制某些細菌的作用。一個是脫水徹底，適合于長途運輸和長期保存。凍干特別適用于對熱敏感、易吸濕、易氧化的白蛋白。對于極個別的在凍干時易變性失活的白蛋白則要十分謹慎，務必先做小量試驗證明凍干對該

20、白蛋白活性、結構無損害后可進行大量處理。 由于白蛋白對熱敏感，因此，要低溫保存。一般可根據白蛋白的用途決定其保存溫度是4oc、-20oc還是-80oc或-196oc液氮中。白蛋白解凍時勿直接由-20oc或-80oc移至37oc條件解凍，因為溫度改變太大或太快，容易引起白蛋白凝結而發生沉淀。正確的凍溶步驟是：將白蛋白從-20oc或-80oc轉移至4oc條件下解凍1天，然后再轉移至室溫下溶解，在溶解過程中要規則地均勻搖晃，使溫度與成分均勻，以減少沉淀的發生。由于白蛋白性質不穩定，因此，要選擇符合白蛋白性質的保存方法，在保證白蛋白生物活性的條件下運輸。5 檢驗方法 人胎盤血白蛋白有10%或25%兩種

21、規格，本制劑為淡黃色略帶粘稠狀的澄明液體或白色疏松物體（凍干品）。按中華人民共和國藥典2005年版白蛋白制造機檢定規程的各項規定進行生產，均應符合規定。【8】以下標準供參考，溶解時間：本品凍干制劑配成10%蛋白濃度時，其溶解時間不得超過15min;水分：凍干制劑水分含量不得超過1%；PH:6.6-7.2；【9】白蛋白含量：應不低于本品規格（10%或25%）；純度：藥品中含有白蛋白應占藥品整體的95%以上；殘留硫酸銨含量：應不超過0.01%（質量體積分數）；無菌試驗、毒性試驗、安全試驗、熱原試驗均應符合規定。【10】結論：白蛋白中的某些陰離子，尤其是一系列脂肪酸的陰離子，在白蛋白等電點的偏酸側時，能提高白蛋白的耐熱能力。脂肪酸可與白蛋白結合生成復合物，成為保護劑。所以可利用加入的辛酸鈉作為白蛋白的保護劑，通過加熱處理的方法使其他不耐熱的蛋白質變性，提高白蛋白的純度和收率。最后一次鹽析沉淀后的透