1、MALDITOF MS病原體鑒定質量保證專家共識基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization timeofflight mass spectrometry, MALDITOF MS)作為一種新興的軟電離質譜技術，由于其具有快速、準確、靈敏、自動化及高通量等檢測特點，已成為一項革命性病原體快速鑒定技術被用于臨床微生物實驗室，并將逐步取代常規病原體生化鑒定方法。任何新興技術應用于臨床都需要建立規范的質量保證體系，以確保檢測質量。本專家共識將對開展MALDITOF MS用于病原體鑒定的設施與安全要求、人員培訓與能力評估、MA

2、LDITOF MS病原體鑒定過程的質量控制、檢驗程序性能驗證等進行建議。設施與安全要求1風險評估：擬開展MALDITOF MS病原體檢測的實驗室需在風險評估基礎上建立有效的安全防護策略，包括設備的使用、化學試劑的安全使用和處理丟棄、感染性病原體和被污染材料的處置等。風險評估包含確定工作流程和鑒定步驟中可能發生的化學和生物危害，以及降低風險的方法。2安全防護：任何操作臨床病原體樣本或病原體的實驗活動至少需要在二級生物安全實驗室(BSL2)中進行。MALDITOF MS應安置在二級生物安全實驗室內，同時使用MALDITOF MS檢測臨床病原體樣本時除了需考慮生物危害的風險外還要注意化學試劑的潛在風

3、險。人員培訓與能力評估各實驗室應具備MALDITOF MS檢測過程中涉及的所有操作人員的初次培訓和定期能力評估的程序文件，對涉及的所有操作人員應進行初次和定期(至少6個月一次)的培訓以及能力評估，培訓考核需遵循制造商的使用手冊或實驗室的標準操作規程，培訓的內容包括原理方法、信息技術、儀器維護、結果報告與解釋等方面。此外，還應采用一組形態和生化特征典型的菌株對培訓者進行人員比對和/或考核，以確保所有操作者鑒定結果的一致性。通過培訓，要求每位操作人員對每種病原體的鑒定結果必須達到本實驗室設定的每種病原體的最小結果閾值。保存所有培訓、考核和能力評估記錄。建議1對于臨床常見細菌(非高致病)，操作人員的

4、個人防護應按標準預防要求，其病原體分離培養、蛋白提取及靶板點樣時應在生物安全柜內進行，點樣后的靶板轉移至MALDITOF MS，分析過程中也需注意生物安全防護；對潛在的含生物危害二類及以上的高致病病原體如布魯菌、炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌等的臨床樣本，實驗室人員應請示醫院感染管理部門并盡量避免培養檢測，必要情況下需要在生物安全柜內采用經滅活程序滅活后再進行質譜分析。建議2前期的樣本處理過程中將會使用一些有機溶劑如乙醇、甲酸、乙腈、三氟乙酸和基質液等，這些溶劑具有腐蝕性或可燃性，可引起人體皮膚黏膜腐蝕、呼吸及循環系統功能紊亂、多臟器損傷，因此在實驗的過程中使用此類有機溶劑試劑時建議有一個良好的通風環

5、境，同時需加強操作人員的呼吸道、皮膚黏膜尤其是眼面部的個人防護。MALDITOF MS病原體鑒定過程的質量保證質量保證可確保MALDITOF MS病原體鑒定結果的準確性和及時性，其內容涵蓋分析前、分析中和分析后。(一)分析前1菌株準備：所有菌株均采用新鮮培養(1648 h)的單個菌落，推薦細菌采用血瓊脂平板培養，真菌采用沙保羅平板培養，凍存菌株傳代兩次后使用。2靶板點樣：先將質控菌株/蛋白標準品點在靶板相應孔位，再點待測菌落。點樣時應注意菌量適當、厚度均勻，不可帶有瓊脂成分。3加基質液：點樣后加入基質液，應自然涼干。4特殊病原體：如分枝桿菌、絲狀真菌和諾卡菌等需要通過蛋白提取法進行提取前處理，

6、包括使用甲酸、乙腈、破壁硅珠管等試劑耗材。詳細處理過程建議參考制造商提供的SOP進行操作。5樣本準備注意事項：(1)靶板點樣加入基質液后，需完全干燥形成結晶方可進行檢測。(2)靶板準備完成后，如為細菌或酵母菌，需在48 h內完成檢測；如為分枝桿菌，需在4 h內完成檢測；如曲霉菌等絲狀真菌，需立刻完成檢測。(二)分析中一般情況下，MALDITOF MS檢測可以得到以下幾種鑒定結果：(1)高置信的鑒定結果；(2)多個鑒定結果，且每個結果的置信度相似；(3)無鑒定結果。1結果判斷：當MALDITOF MS提供了高置信的結果時，無需對圖譜進行檢查和復核；而當出現多個鑒定結果或無鑒定時，可能出現以下問題

7、：(1)低質量的圖譜導致無鑒定結果：需檢查菌株和試劑耗材的質量、儀器性能狀態以及具體操作環節；(2)圖譜質量較好而不符合預期的鑒定、多個鑒定結果或者無鑒定結果：應檢查樣本是否分純、是否污染或數據庫不包含待檢菌種。2結果閾值：目前MALDITOF MS的結果閾值通常分為兩種：一種以置信度為閾值，置信度>90%的單一結果為優質鑒定結果，60%90%且具有多個鑒定結果為低分辨結果(需要補充實驗進行分類)，<60%為不能鑒定；另一種則以分值為閾值，質譜評分>2分(9.5分)的結果可以鑒定到種，1.7至2.0分(9.09.5分)之間可以鑒定到屬(需要補充實驗進行分類)，<1.7分

8、(9.0分)為不能鑒定或可能鑒定到屬。(三)分析后1結果復核：鑒定結果的復核是分析后質量管理的重要組成部分，是保證檢驗結果準確的一個重要環節。MALDITOF MS鑒定結果為以下病原體時，需通過相應的補充實驗進行進一步鑒別。2儀器維護及保養：按照制造商要求定期進行維護及保養。3化學試劑：必須使用儀器制造商要求純度的化學試劑。質量控制(一)室內質控建議3需血清學試驗確認的病原體：大腸埃希菌(疑似志賀菌屬和大腸埃希菌O157)、沙門菌屬等；需要其他確認試驗進行鑒定的病原體：煙曲霉復合群、黃曲霉復合群、肺炎鏈球菌和緩癥鏈球菌群等；需要測序鑒定或報告到群：蠟樣芽孢桿菌復合群、洋蔥伯克霍爾德菌復合群、鼻

9、疽伯克霍爾德菌和類鼻疽伯克霍爾德菌、無色桿菌屬、弗勞地檸檬酸桿菌復合群和陰溝腸桿菌復合群等。實驗室需按照MALDITOF MS制造商的推薦及相關管理指南制定質控程序。按照制造商要求評估質量分析器、相關系統(軟件和數據庫)、化學試劑、靶板和用戶的操作(靶板點樣、有條件時萃取)。1質控菌株：質控陽性對照菌株種類應根據實驗室擬開展的鑒定病原體范圍進行選擇，質控菌株可采用制造商建議的標準菌株或經實驗室測序等方法確認的臨床菌株。所有質控陽性對照菌株進行質控操作時需采用新鮮培養(1648 h)的單個菌落，推薦細菌采用血瓊脂平板培養，真菌采用沙保羅平板培養，凍存菌株傳代兩次后使用。2質控操作及頻率：按照制造

10、商的SOP文件要求，在靶板清洗、基質溶液及標準品溶液配制后需每次進行陰性及陽性對照的質量控制，每次病原體鑒定時亦應如此。3儀器校準：檢測前儀器需進行自身校準，校準通過后方可進行后續鑒定。4陽性對照：使用大腸埃希菌標準菌株(ATCC8739)鑒定分值必須達到制造商要求；如使用標準蛋白測試品，在分子量大于12 000以上的區域必須出現校準峰，應明確檢測到m/z 13 683和16 952兩個峰，確保高分子量端的準確性。5陰性對照：檢測結果應為"No peak found"或者"無鑒定結果"。陰性對照需使用空白試劑，用于排除可能由試劑污染或重復性靶板(陰性對照

11、應為任意孔位)清洗不當造成的假陽性結果。當質控結果失控或校準未通過時，應從各環節分析原因并予以糾正。常見原因包括：質控菌株/蛋白標準品污染、使用錯誤的質控菌株/蛋白標準品、使用錯誤的試劑、操作人員的操作失誤等。記錄分析失控原因并歸檔。如果未發現上述明顯的原因可重復測定質控菌株/蛋白標準品，結果在控，可直接進行后續檢測；若不能糾正，應聯系制造商采取相應的措施。(二)室間質評建議4其他質控菌株(標準菌株或經驗證的臨床菌株)，包括革蘭陰性桿菌(建議采用產氣腸桿菌)、革蘭陽性球菌(建議采用糞腸球菌)和念珠菌(建議采用光滑念珠菌)。室間質評：全程參加由組織方提供的室間質評計劃。當出現室間質評不符時，及時

12、找到失控原因并糾正。保存每次室間質評信息，包括結果反饋、糾正措施等。無第三方組織的室間質評計劃時，實驗室應定期自行組織與其他實驗室同類檢測方法的室間比對。檢驗程序性能驗證MALDITOF MS性能驗證包括準確度和精密度。通過MALDITOF MS和現用方法或參考方法(如測序方法)獲得的病原體鑒定結果進行比較以實現準確度驗證。準確度驗證盡可能包括臨床菌株而不限于是質控菌株或標準菌株。精密度驗證應包括所有主要可能存在的變量，如不同的培養基、培養條件和提取技術，通常用標準菌株或質控菌株進行精密度驗證，應評估批內、批間，操作者之間以及連續幾天的重復性或再現性。在適用的情況下，還應評估病原體MALDIT

13、OF MS與LIS或其他儀器系統之間接口的正常運行。(一)適用范圍1實驗室引入SFDA批準的MALDITOF MS檢測系統時，使用前應進行全面驗證。2實驗室使用MALDITOF MS時，若對病原體種類、試劑、數據庫、分析軟件和硬件等進行更換或升級以及擴大檢測范圍(即在原有檢測病原譜基礎上增加新的病原體)后，應進行部分驗證。建議5性能驗證符合要求后投入臨床常規使用，在設備狀態、環境、檢測方法、人員等維持穩定的情況下，可采用文件和數據審核等定期評審分析系統狀態，無需每年實施性能驗證。(二)驗證方案MALDITOF MS驗證所用菌株按優先順序依次選擇標準菌株、質控菌株或經參考方法確認的臨床菌株，選擇

14、的菌種應盡量覆蓋MALDITOF MS制造商公布的可鑒定菌譜，包括革蘭陽性及陰性球菌、革蘭陽性及陰性桿菌、厭氧菌、酵母菌、苛養菌、分枝桿菌等，同時還應覆蓋驗證本地區、本實驗室以往檢出的特殊病原體種類。1全面驗證：準確度：常見病原體如革蘭陽性及陰性球菌、革蘭陽性及陰性桿菌、酵母菌每種類別至少驗證30株，厭氧菌、苛養菌、分枝桿菌(如開展)、絲狀真菌(如開展)每種至少10株，并覆蓋本地區、本實驗室檢出的重要病原體。比較MALDITOF MS鑒定結果與實驗室現用方法或參考方法(如測序方法)之間的符合率。精密度：選擇10株代表性菌株，每天重復檢測3次，連續3 d。2部分驗證：見表1。適用范圍舉例推薦方案

15、擴大病原譜補充某一種病原體準確度：選擇10株以上該種類病原體，與現用方法或參考方法(如測序方法)比較精密度：1日內重復檢測質控菌株3次試劑種類改變商品化試劑改為自配試劑設備重大修理更換離子檢測器或激光源按照上述方案進行檢測性能和LIS數據傳輸驗證表1 常見情況下驗證方案(三)可接受標準嚴格按照制造商使用說明的要求進行結果判讀(參考環節控制中的結果閾值)。1準確度要求：驗證的標準/質控菌株符合率應為100%，臨床菌株的符合率應在90%以上。2精密度要求：菌株鑒定結果符合率應為100%。若未能滿足上述驗證要求，則MALDITOF MS不能通過驗證。制造商和/或使用者須采取相應措施，修正后的檢測系統應再次進行驗證。以上專家共識內容僅限于MALDITOF MS用于臨床病原體鑒定的質量保證要求，MALDITOF MS作為蛋白質組學研究的支柱技術，在醫學及生命科學領域有更多的應用前景和價值，其他相關領域的應用的質量保證要求不包括在本次