1、RealtimePCR操作步驟：從采樣到數(shù)據(jù)處理1 .米樣：1.11.1 采樣前的準(zhǔn)備：DEPC 水，滅菌手術(shù)刀剪，75%酒精，2mL 無(wú) RNA 酶離心管，2 個(gè)盛有 DEPC 水的燒杯，一個(gè)用于沖洗樣品，一個(gè)用于放置手術(shù)刀剪，以減少外界污染。1.21.2 采樣過程中的注意事項(xiàng)：采樣人員需帶好口罩和手套，并且盡量少講話。當(dāng)雞放血致死后，立即解剖，并優(yōu)先取 RNA 試驗(yàn)用樣品。取樣量約 100mg 左右（根據(jù) RNA 提取方法不同可改變?nèi)恿浚M量保證每管取樣大小和部位接近一致（可事先取些樣品，有個(gè)大概的標(biāo)準(zhǔn)即可）。RNA 樣品采集于離心管中，立即投入液氮（或者 RNA 保存液中）凍存，最后

2、統(tǒng)一轉(zhuǎn)入-70C 冰箱。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件選擇 RNA 樣品的保存方式，優(yōu)先選擇液氮保存。建議：如果直接投入液氮保存，離心管蓋子要蓋嚴(yán)，以免液氮滲入管中，導(dǎo)致離心管在轉(zhuǎn)入-70C冰箱時(shí)管蓋崩開使樣品損失。2 .總 RNA 提取提取組織和細(xì)胞總 RNA 推薦使用 Trizol 法。2.12.1 TrizolTrizol 提取總 RNARNA 的操作步驟以下操作需在超凈臺(tái)中進(jìn)行，超凈臺(tái)使用前需用 75%酒精擦拭臺(tái)面，紫外燈照射半小時(shí)后，打開風(fēng)機(jī)排除臭氧，減少對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的傷害。此外，要提前制冰備用。每 50-100mg 樣品加 1mlTrizol,使用高通量研磨儀研磨 30s。研磨后樣品放置 5min,4

3、C12000g 離心 10min,上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè) 1.5ml 無(wú) RNA 酶離心管中（已冰上預(yù)冷）。加入 200 山氯仿，用力搖晃 15s,室溫放置 5min。412000g 離心 15min,上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè) 1.5ml 無(wú) RNA 酶離心管中（已冰上預(yù)冷）。加入 500L 異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置 10min,沉淀 RNA。4C12000g 離心 10min,棄上清。加入 1ml75%乙醇（DEPC 水配制），用移液器反復(fù)吸打乙醇，洗滌 RNA 沉淀。4C7500g 離心 5min,棄去乙醇。9）用微型離心機(jī)將 EP 管內(nèi)壁上的乙醇甩至管底，用 10L槍頭吸出，打開蓋子置于超凈

4、臺(tái)內(nèi)晾十幾秒，但不能讓 RNA 全部干透，內(nèi)壁上沒有水珠即可。10）根據(jù) RNA 的量加入無(wú) Rnase 水 60-120 科 L,輕彈管壁，充分溶解 RNA,混勻后分裝出少許用于測(cè)定RNA 濃度以及用于電泳檢測(cè)。11）測(cè)定 OD260/OD280值以及 RNA 濃度。取 15RNA 用 DEPC 水稀釋 100 倍，紫外分光光度計(jì)下讀取RNA 濃度彳 1 和 OD260/OD280值（1.9-2.0 之間表示 RNA 純度較好，小于 1.8 說(shuō)明含蛋白質(zhì)、雜質(zhì)較多，大于 2.2 表示 RNA 降解）。建議：建議使用 200 山的槍頭轉(zhuǎn)移上清液，可減少蛋白污染。可用柱式 RNA 提取試劑盒，推

5、薦 TAKARA 公司的產(chǎn)品，提取速度快，無(wú)毒性，質(zhì)量很好，價(jià)格比較高。Trizol推薦invitrogen公司的產(chǎn)品， 直接從公司訂購(gòu)要1200元/100mL,從科昊澤訂只要750元/100mL,所以可以多咨詢比對(duì)代購(gòu)的價(jià)格。3 .反轉(zhuǎn)錄 cDNA多用轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行 cDNA 反轉(zhuǎn)錄，按照對(duì)應(yīng)說(shuō)明書操作即可。反轉(zhuǎn)錄過程需在超凈臺(tái)中進(jìn)行。Invitrogen 和 TAKARA 的 cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的質(zhì)量很高。Invitrogen 的試劑盒步驟稍微繁瑣，但最后得到的終產(chǎn)物量多。TAKARA 的轉(zhuǎn)錄速度快，但終產(chǎn)物量少。我 所 用 過 的 產(chǎn) 品 Invitrogen 的 貨 號(hào) 是 C28

6、025-032 （ 50 次 反 應(yīng) ） ， TAKARA 的 是PrimeScriptRTMasterMixPerfectRealTime,貨號(hào) DRR036A（200 次反應(yīng)），和之后用的熒光定量試劑盒可以搭配使用。建議：cDNA 體系中 RNA 模板的濃度要一致，可用體系要求模板濃度和所測(cè)出的 RNA 濃度計(jì)算所需加模板量和無(wú) RNA 酶水的量。推薦用 excel 計(jì)算，并打出表格，參照表格進(jìn)行加樣。4 .引物PCR 引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核甘酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板 DNA 序列。引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到 PCR 產(chǎn)物的特異性及成功與否。根據(jù)試驗(yàn)選擇引物。做 Real-time

7、PCR 的引物片段最好在 200bp 以下。可通過查找相關(guān)英文文獻(xiàn)來(lái)選擇引物，文獻(xiàn)中會(huì)標(biāo)注目的基因的引物、引物片段長(zhǎng)度和在 NCBI 上的編號(hào)。如果引物查找不到，也可自行設(shè)計(jì)，在 NCBI 上查找所需基因，得到基因的堿基序列，用 DNAMAN 設(shè)計(jì)。確定了引物序列后，交由公司訂購(gòu)，獲得引物后需要驗(yàn)證是否能用。建議：實(shí)驗(yàn)室所用引物主要在 invitrogen 公司設(shè)計(jì)，3 天左右能獲得引物，也可以在金維智設(shè)計(jì)引物。國(guó)內(nèi)公司生產(chǎn)速度較快，1 天左右就能完成。5 .RealtimePCR使用 TAKARA 的 SYBRPremisExTaqII（PerfectRealTime）試劑盒。試劑盒的實(shí)驗(yàn)原

8、理如下:SYBR.GreenI 是熒光定量 PCR 最常用的 DNA 結(jié)合染料，能與雙鏈 DNA 非特異性結(jié)合，結(jié)合后發(fā)出熒光，可以通過檢測(cè)反應(yīng)體系中的 SYBR?GreenI 熒光強(qiáng)度，達(dá)到檢測(cè) PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。PCR 反應(yīng)生成雙鏈 DNA,SYBR?GreenI 與雙鏈 DNA 結(jié)合后會(huì)發(fā)出熒光， 通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，不但可以檢測(cè)反應(yīng)體系中的 DNA 的擴(kuò)增量，同時(shí)還能測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的 DNA 熔解溫度。具體原理見下圖：3.延伸反應(yīng)延伸反應(yīng)嵌合熒光染料法原理圖根據(jù)說(shuō)明書中不同的熒光定量?jī)x器對(duì)應(yīng)反應(yīng)體系配制不同的反應(yīng)液。耗材多用 96 孔板（半裙邊）和 8 聯(lián)管（8 聯(lián) TUBE）

9、。加樣方式推薦先用無(wú)菌離心管混好除樣品外的所有試劑，顛倒混勻，短暫離心，再分裝到每個(gè) PCR 管中，取第一管時(shí)用槍頭吹打數(shù)次。分裝好后，再向管中加入樣本。按照說(shuō)明書要求設(shè)置程序后，開始進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。每個(gè)樣品做 2-3 個(gè)重復(fù)，初上手建議做 3 個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)處理時(shí)比較好剔值。擴(kuò)增結(jié)果中 Ct 值標(biāo)準(zhǔn)差小于 0.5 時(shí)表示技術(shù)重復(fù)性好。5.ComparativeDelta-deltaCt 法ComparativeDelta-deltaCt 法即 AACCfe,是一種常用的相對(duì)定量方法，其最大特點(diǎn)是，當(dāng)優(yōu)化的體系已經(jīng)建立后，在每次實(shí)驗(yàn)中無(wú)需再對(duì)看家基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需對(duì)待測(cè)樣品分別

10、進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增即可。此方法的缺點(diǎn)是，每次實(shí)驗(yàn)都默認(rèn)目的基因和看家基因的擴(kuò)增效率一致，而并非真實(shí)擴(kuò)增情況的反映，這里勢(shì)必存在一定的誤差。所以在正式試驗(yàn)開始前，必須對(duì)目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，如果兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之差小于 0.1,那么后續(xù)實(shí)驗(yàn)中就可以用 AAC 怯進(jìn)行相對(duì)定量分析。反之，如果斜率差值大于 0.1,就無(wú)法用該方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。只能優(yōu)化反應(yīng)條件或選擇絕對(duì)定量方法進(jìn)行分析。熒光定量?jī)x器所帶的軟件可以給出兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的 R2值、擴(kuò)增效率、斜率等信息。如下圖所示：熱變性熱變性2, ,引物退引物退火火Primerin對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋（1:5）,分別對(duì)目的基因（HIF-1）和看家

11、基因（actin）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。二者斜率分別為-3.159 和-3.264,差值小于 0.1,所以可以用 AAC 怯對(duì)兩種基因進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行正式試驗(yàn)，對(duì)看家基因和目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到一系列 Ct 值。導(dǎo)出數(shù)據(jù)前，可以先在軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 調(diào)整所有結(jié)果中同種基因閾值 （Threshold） 相同。 根據(jù)熔解曲線 （MeltCurve）剔除熔解曲線異常的數(shù)據(jù)。導(dǎo)出數(shù)據(jù)后，根據(jù)相對(duì)定量公式（2-AACt 計(jì)算每個(gè)樣品基因的相對(duì)表達(dá)量。樣品目的基因 CtMean看家基因CtMeanCtCt八ACt2對(duì)照組X1X2X1-X2實(shí)驗(yàn)組Y1Y2Y1-Y2(Y1-Y2)-(X1-X2)2-(Y1-Y2)-(

12、X1-X2)Ct=CtMean目的基因-CtMean看家基因；Ct=ACt實(shí)驗(yàn)組-Ct對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的基因表達(dá)差異為2-AACt數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行選擇。111actinactinactinSTANDARDSTANDARDSTANDARDSYBR4-loneSYBR-NoneSYBR-None207142033020.7875actinSTANDARDSYBR,one22,5635actinSTANDARDSYBR-None22,6495actinSTANDARDSYBR-Non&22.73325actinSTANDARDSYBR-None24,79125actinSTANDA

13、RDSYBR-Tlone24.92725actinSTANDARDSYBRone24,848125actinSTANDARDSYBRAIone27,497I25actinSTANDAFCSYER-Mone27.517125actinSTANDARDSYER-None27.625StandardCurve口一叫7?1hrf-1STANDARDSYBR.-CJone25.9441hif-1STANDARDSYBR-None25.6701hif-1STANDARDSYBR-Nane25,8445hif-1STAPIDFC SYBR-NOHT27,9535hif-1STANDARDSYBR-Non-?27.9405hif-1STANDARDSYBR-Ilone20.