1、編碼抗原重組蛋白C33C,NS5;合成多肽5-1-1, C100,C22的丙肝病毒CHIRONHCV3.0SIA針對人血清或血漿中丙肝病毒抗體anti-HCV的條帶免疫印跡試驗SIA適用于體外診斷編碼抗原重組蛋白C33C,NS5;合成多肽5-1-1, C100,C22的丙肝病毒CHIRON RIBA HCV3.0 SIA針對人血清或血漿中丙肝病毒抗體anti-HCV的條帶免疫印跡試驗SIA適用于體外診斷產(chǎn)品編號930600目錄頁碼命名和使用目的 2試驗概述和說明 2試驗的生化原理 3試齊I 4試劑制備 6儲存說明 7試劑變質(zhì)指示 8樣本收集和準備 8程序 9提供材料30人份試劑盒；產(chǎn)品編號 9

2、30600 9需要但不供應(yīng)的材料 9主要陳述 9試驗程序 9質(zhì)量限制程序 11結(jié)果解釋 11程序的局限性 12預(yù)期結(jié)果 13具體的性能特征 17關(guān)鍵符號 19參考文獻 20發(fā)行日期：2007-12諾華疫苗和診斷試劑公司100125121 .命名和使用目的CHIRON RBAHCV3.0 SIA是一種針對人血清或血漿來自為輸血或血液再造的捐贈者中丙肝 病毒編碼的單個蛋白所對應(yīng)的抗體的體外定性酶免印跡測定,它主要是一種對經(jīng)類似ELISA等許可的抗HCV篩選步驟重復(fù)篩查的活性人血清或血漿樣本進行輔助的,更具體的測試手段.2 .測定概述和說明正如Ebeling等人所描述的,條帶免疫印跡測試SIA已經(jīng)在

3、說明丙肝對應(yīng)的單個抗體方面展示出用性,通過SIA法對抗HCV的檢測是基于傳統(tǒng)的 Western-blotting技術(shù),在這項技術(shù)中,HCV基因組編碼的特異性抗原被固定在一個膜支持物上.因HCV碼的單個蛋白而產(chǎn)生的抗HCV活性的可視化是通過使用酶標記的抗人IgG對酶底物的比色實現(xiàn)的.CHIRONRIBAHCV3.0 SIA是一種體外定性免疫印跡測定,它把重組HCV編碼抗原和合成 HCV編碼多肽分別固定在測試條帶上.兩個重組抗原 C33C和NS5及兩個合成多肽C100P和5-1-1P 是源于推測的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白,然而第三個多肽C22P被推測對應(yīng)于病毒的核衣殼蛋白,由于重組HCV C33C和NS5抗

4、原是以一種和人源過氧化物岐化酶hSOD融合表達的形成得到的重組蛋白,所以hSOD也被單獨表達作為條帶上的對照帶.這個對照條帶可以排除重組蛋白中本不屬于HCV本身編碼的hSOD局部所對應(yīng)的抗體.HCV C33C抗原產(chǎn)生于大腸桿菌E.coli基因重組表達,而HCV NS5 抗原和hSOD產(chǎn)生于釀酒酵母S.serevisiae體系的基因表達.把基于早期重組抗原的 RIBA HCVSIA結(jié)果值作為單抗原或多抗原的抗HCV篩選試驗的補充實驗已經(jīng)出現(xiàn)在多篇已發(fā)表的論文當中.然而,已通過多抗原篩選步驟重復(fù)驗證為局部活性樣本卻在RIBA HCV 2.0 SIA試驗中成了不確定樣本.推測的包含 HCV抗原的HC

5、V基因組定位如圖一所示工a a.1 Ep1一2OT-11QQ-O- 1Amino Ac tdFigure 1Membrane Binding Functldi5-Q O 154日m a 1935Halncase ProleaM FuncbOinM a m braneEiive tape jBii i dingFunctiong 1-1 p42 a.a.10 -c33c據(jù)報道,非 A,非B NANB肝炎占據(jù)輸血后肝炎的80-90%,這類肝炎最顯著的特點是半數(shù)的感染病人會開展成慢性肝炎,其中的20雙有可能進一步開展成肝硬化.接種過慢性黑猩猩會通過連續(xù)的病毒渠道傳染到其它黑猩猩體內(nèi),這個實驗證實了可

6、轉(zhuǎn)移的NANB肝炎病人血清的NANB!介的存在.一個NANB干炎的嚴格定義指除甲肝,乙肝,delta肝炎,巨細胞病毒感染和以及其它原因的肝臟發(fā)炎等之外的肝炎.一般NANBgj染是溫和的,病例中的Epstein-Barr病毒感染,75艱無黃疽的,病例中病癥溫和的比例甚至更高.但是NANB肝炎也具爆發(fā)性.Mathiesen等已經(jīng)揭示出所有爆發(fā)性肝炎病例中,36診斷為NANEB染者.NANB肝炎媒介的基因組已經(jīng)從帶有高滴度媒介的受感染的黑猩猩血漿中被克隆得到,這個媒介已經(jīng)被指定為丙肝病毒. 重組的HC的碼蛋白已經(jīng)被利用開展為檢測人血清和血漿中抗HCV勺第一代單抗原和第二代多抗原檢測篩選測定.具有顯著

7、特征的 后和社區(qū)型獲得NANB干炎間的具體關(guān)系.NANB panel數(shù)據(jù)說明了 HCV抗體與輸血RIBAHCV邕3.0 SIA , when used as directed in this insert,可以檢測人血清或血漿中HCV的抗體.呈現(xiàn)在測試紙帶上的單個的抗原帶可以確認抗特異的假定病毒抗原的抗體活性.3.測試的生化原理RIBA勵HCV 3.0 SIA是一個利用固定在測試條帶上的重組HCV抗原或合成多肽形成的單一帶進行的三步試驗.第一步,樣本和試驗對照被稀釋并于條帶上孵育.假假設(shè)有的話,那么其中的特異的HCV抗體將結(jié)合到對應(yīng)的重組抗原或者合成多肽條帶位置.血清或血漿中未結(jié)合組分通過抽吸

8、和沖洗被去除掉.第二步,條帶被孵育在含過氧化物酶標記的抗人igG結(jié)合物中,這個結(jié)合物被結(jié)合到抗原抗體復(fù)合物的人IgG部位,未結(jié)合的結(jié)合物的去處通過傾倒和清洗步驟來完成.第三步,包含有過氧化氫和4-氯-1-蔡酚的可借酶進行反響底物顯色系統(tǒng)被參加,如果結(jié)合物是存在的,那么在特異性的抗原,多肽或者對照帶位置,酶促反響后將產(chǎn)生一種可溶性的藍黑背景的產(chǎn)物,顯色反響與過氧化氫對過氧化物酶的二價氧化有關(guān),接著氧化狀態(tài)的過氧化物酶分別靠兩個共價鍵與4-氯-1-蔡酚反響而恢復(fù)到正常狀態(tài),并導(dǎo)致產(chǎn)生可溶性的藍黑色的反響產(chǎn)物.條帶上的顏色產(chǎn)生以后,反響通過反響物的去除和洗滌而終止.肉眼可見的出現(xiàn)在條帶上的帶型是結(jié)合

9、在條帶上單個重組抗原或合成多肽所對應(yīng)抗體的直接反映,對應(yīng)每個抗原帶的樣本活性通過肉眼對條帶上的低濃度的IgG和高濃度的IgG產(chǎn)生的隱性和陽性對照而被確定.如圖三所示.產(chǎn)生陽性對照物的血清或者血漿被處理以4.試劑RIBAHCV3.0 SIA是一個30人份試劑盒產(chǎn)品編號 930600組分描述供量|STRIP HCV編碼抗原重組C33C和NS5抗原,合成30個連續(xù)號的條帶：提供在 6個密閉袋中；每個 袋中含有5個條帶,并各自被置于軟管中的C5-1-1,C100,C22多肽覆蓋的條帶： 每個條帶包含 4 個HCV編碼抗原/多肽帶,1個重組人SOD帶,2條IgG 對照帶Sd卜沖液 酸鹽作車本稀釋液：帶有

10、牛蛋白穩(wěn)定劑和去污劑的磷酸鹽緩PBS.包含有0.1%疊氮化鈉和0.05%慶大霉素硫 為防腐劑含100ml溶液的瓶子CON結(jié)合物：過氧化酶標記的抗人IgG 重鏈和輕鏈,含65ml溶液的瓶子含有牛蛋白穩(wěn)定劑,含有 0.01%硫汞撒作為防腐劑4CN底物溶液：4-氯-1-茶酚的甲醇溶液含12ml溶液的瓶子SB代E物緩沖液：過氧化氫的磷酸緩沖液含60ml溶液的瓶子WB洗液濃度50x：含有0.01%硫汞撒防腐劑的和去污含80ml溶液的瓶子劑的磷酸緩沖液pC F 清或血 抗HIV0.1% 差小生對照人源：滅活的包含有抗 HCV抗體的人血 漿；并通過 FDA認證實驗測試對 HbsAg,抗HIV-1, -2 ,

11、抗HTLV-1和HTLV-2抗體無反響活性,包含有 W氮化鈉和0.05%慶大霉素硫酸鹽作為防腐劑含0.3ml溶液的小瓶Nc抗HIV性的人素硫酸陰性對照人源：經(jīng)FDA認證實驗測試對 HbsAg, /-1,抗HIV-2 ,抗HTLV-1和HTLV-2抗體無反響活 血清或血漿,包含有0.1%疊氮化鈉和0.05%慶大霉 鹽作為防腐劑含0.3ml溶液的小瓶注意：所有樣本要當做含有可傳染性的媒介成分進行處理.儲存在2-8 C 不要冰凍針對體外診斷使用chiron 底Riba hcv3.0 sia 滿足 fda 要求5.提醒1 .所有實驗樣本要當做含有可傳染性的媒介成分進行處理.滅活其中的丙肝病毒.另外,使

12、用的血清或者血漿要通過FDA認證實驗測試驗證對 HbsAg,抗HIV-1,抗HIV-2 ,抗HTLV-1和HTLV-2抗體無反響活性.然而,還沒有哪種滅活過程或者試驗方法可以完 全保證來自人血液的產(chǎn)物不會轉(zhuǎn)移感染性媒介.因此,這些成分必須當做具備轉(zhuǎn)染性媒介進行操作.建議所有試劑和樣本均按已確立的最正確實驗室操作規(guī)程進行操作.2 .不要用嘴吸液.3 .不要在操作過樣本或試劑盒的地方吃喝,抽煙,或者使用化裝品.4 .測試過程中戴一次性手套,之后要徹底洗手.手套要作為醫(yī)療垃圾丟棄.5 .對濺液要迅速地用 0.5%次氯酸鈉溶液進行消毒 利用家用消毒劑1:10稀釋或者等效其它消毒劑. 污染物體應(yīng)該被視為

13、醫(yī)療垃圾丟棄.6 .任何潛在的污染物,包括陰陽對照,人樣本以及相關(guān)與之接觸過的物體都應(yīng)該根據(jù)當?shù)貜U棄物處理 要求被處理并作為醫(yī)療垃圾丟棄.遵照當?shù)貜U棄物處理要求,包括試驗中的抽吸液在內(nèi)的液體醫(yī)療垃圾應(yīng)該在排放到下水道之前用0.5%次氯酸鈉進行消毒.家用消毒劑按1:10體積比進行稀釋7 .包含甲醇和硫汞撒組分的試劑盒組分以及含有該類物質(zhì)的廢液可能潛在的被分類為醫(yī)療垃圾.因 此,因此它們也應(yīng)該參照當?shù)貜U棄物處理要求被丟棄.8 .陰性和陽性對照以及稀釋的樣本都含有防腐劑疊氮化鈉,疊氮化鈉已經(jīng)被報道會和鉛及銅探測器潛 在的形成爆炸性的金屬疊氮化物.因此,不要使用金屬管物作為實驗室容器,同時要一直沖洗足

14、夠體 積的水以金屬的疊氮化物堆積在探測系統(tǒng).9 .預(yù)防眼睛,皮膚或者衣物與底物溶液4-氯-1-蔡酚接觸.假設(shè)底物溶液與眼睛或者皮膚有接觸的話,應(yīng)徹底用水沖洗.警告：底物溶液中的 4-氯-1-蔡酚是一種危險物質(zhì),所以它的棄除應(yīng)按當?shù)匾?guī)章制度進行.警告：底物溶液包含甲醇.高度易燃.吸入吞咽的話有毒.應(yīng)保持容器緊緊密閉.遠離 燃源.不要抽煙.預(yù)防與皮膚接觸.萬一有意外發(fā)生,或者身感不適,應(yīng)立即尋找醫(yī)療幫助.可以的話要標上瓶簽10 .使用之前,要把所有的試劑盒試劑成分和樣本置于室溫15-30 C大約30分鐘,不使用的試劑要放回到2-8 C.11 .不同試劑盒間的試劑 試劑盒組分和/或和條帶不要交叉使用

15、. 不同生產(chǎn)批號的試劑盒組分和條 帶禁止一起使用.12 .不要替換用于試劑盒中的陰性陽性對照.13 .不要剪條帶.更窄的條帶可能導(dǎo)致錯判.任何針對條帶上的的人為操作都可能會出錯或者可能阻 止道反響帶的識別.14 .超過有效期后不要再使用該試劑盒.具體日期被印刷在試劑盒盒體上.15 .測試條帶和試驗軟管只能使用一次.一旦已經(jīng)用于試驗不要再使用測試條帶和軟管.16 .不要交換小瓶或瓶子的塞子和蓋子；否那么會導(dǎo)致試劑的交叉污染.17 .條帶操作過程中不允許條帶干掉.試驗全部18個步驟步驟中5個步驟18 .為預(yù)防褪色,保持操作過程中的條帶避光例如,陽光直射和避熱高于30C.19 .試驗過程中禁止有氯消

16、毒劑容器或者其它源頭中的次氯酸鈉蒸汽接觸到條帶,由于顏色反響可能 會因此終止.20 .溫和處理條帶.整個操作過程戴手套并使用鐐子以預(yù)防對條帶的污染.21 .工作洗液要用蒸儲水或去離子水.臨床實驗室試劑用水,I型或n型也可以被使用.儲水和洗液 都應(yīng)該在非金屬容器中.22 .試驗之前要保證工作洗液和工作底物都是足夠的.假設(shè)發(fā)現(xiàn)試驗操作當中上述溶液是不夠的話, 試驗操作將是無效的,需要在再次準備好工作溶液后重復(fù)進行.23 .所有的移液設(shè)備均應(yīng)根據(jù)廠商提供的說明書仔細校準過.24 .對每個樣本要使用單個槍頭,以預(yù)防交叉污染.25 .最大操作次數(shù)是30次.每步操作均應(yīng)根據(jù)指定過程完成,不許有中斷.26

17、.每個試驗過程都要含有陰性陽性對照.整個試驗過程陰陽性對照要像病人/捐獻者樣本一樣進行操作詳見第10局部27 .試驗過程中要沒按指定的那樣加等份樣本的話,無論最初的樣本是陰性還是陽性,都將會導(dǎo)致樣本條帶被解釋為陰性.28 .不遵照說明書的操作將會導(dǎo)致一個錯誤的試驗結(jié)果.29 .參照歐洲委員會指令 1999/45/EC和ISO 15223: 2000標準,試劑盒中的一些試劑帶有危險和平安 標志并應(yīng)該相應(yīng)的進行處理.30 .已經(jīng)要求,我們可以提供材料的平安數(shù)據(jù)單.A.以下試劑包含甲醇：底物F. FlaminablT. ToxicR11高度易燃R23吸入有毒R25吞食有毒S7保持容器密閉S16遠離火

18、源-禁止吸煙S24預(yù)防皮膚接觸S45萬一有意外或身體不適,請立即尋找醫(yī)療幫助在允許的地方示以標簽B以下試劑有生物危險陽性對照人陰性對照人6.試劑的準備使用之前,所有的試劑應(yīng)在室溫15-30 C中恢復(fù)溫度,并通過溫和顛倒容器數(shù)次以徹底混勻試劑, 預(yù)防產(chǎn)生氣泡.程序1 .工作洗液的準備： 在一個干凈的玻璃或聚丙烯容器中,根據(jù)表1說明準備足夠的工作洗液.室溫下15-30 C工作洗液在一周內(nèi)事穩(wěn)定的.容器上注明工作洗液的配置時間及有效期.注意：洗液的濃儲液含有去污劑.清洗過程中,殘留的泡沫還會留在洗桶中,然而殘留泡沫的存在不 會影響到實驗結(jié)果.表1:工作洗液準備各種不同數(shù)量的條帶所需試劑量條帶數(shù)量濃儲

19、液體積稀釋所用水+的體積3-512ml588ml6-1013ml637ml11-2015ml735ml21-3017ml833ml+:蒸福水或去離子水2 .工作底物的準備： 在一個干凈的玻璃或者聚丙烯容器中,參照表2說明為試驗準備足夠的工作底物每個樣本最少1ml,每個洗滌容器最少10ml, 一個洗滌容器可以放置 20個條帶.工作底物可以在使用前一個小時內(nèi)準備；并置于黑暗環(huán)境中.任何未使用的工作底物不能被存儲為后續(xù)試驗用.底物中4-氯-1-蔡酚是一種危險物質(zhì)必須根據(jù)當?shù)匾?guī)章制度予以丟棄.記錄容器中工作底物的配置日期和準 確時間以及有效期時間.表2:工作底物準備各種不同數(shù)量的條帶所需試劑量條帶數(shù)量

20、底物溶液的體積底物緩沖液體積3-101.7ml8.5ml111.9ml9.5ml122.1ml10.5ml132.2ml11.0ml142.4ml12.0ml152.6ml13.0ml162.7ml13.5ml172.9ml14.5ml183.1ml15.5ml193.2ml16.0ml20+3.4ml17.0ml+：每個洗滌容器能盛放的最大量7.儲存說明1 .儲存試劑盒或者單份試劑如試劑盒組分于 2-8 C .不能冰凍.2 .不要使用過期的試劑盒或者單個試劑,具體日期被印刷在試劑盒上以及單個試劑組分的標簽上.3 .翻開小袋后條帶應(yīng)該在兩周內(nèi)被使用.不使用的條帶應(yīng)該被放置于原先的軟管中,并重新

21、封閉在內(nèi)含枯燥劑的錫紙袋,置于 2-8 C保存.在小袋上記錄好開袋及條帶的有效期.4 .室溫下15-30 C工作洗液一周內(nèi)是穩(wěn)定的.5 .工作底物當處于黑暗環(huán)境中時,室溫15-30 C下1小時內(nèi)穩(wěn)定.8.試劑變質(zhì)跡象1 .包被好的條帶被密封在帶有濕度指示枯燥劑的保護性小袋中,假設(shè)有過多的水分進入小袋的話,正常狀態(tài)下是藍的或者紫色的枯燥劑將會變成粉紅色.如果枯燥劑是粉紅色的,這個條帶將不能再使用.2 .底物溶液應(yīng)該是無色的.如果它呈現(xiàn)黃色,那么它已經(jīng)被氧化,不能再被使用.3 .使用試劑物理表觀上的改變預(yù)示著這些物質(zhì)的變質(zhì).假假設(shè)這個的現(xiàn)象如顏色上的改變或者帶有微生物污染的濁度上的改變被觀察到的話

22、,它們不能再被使用.9.樣本收集和準備工作樣本收集前對病人或者捐贈者沒有具體的準備工作,然而,利用RBAHCV3.0 SIA試驗的樣本收集要遵循以下原那么：1 .血液采集應(yīng)該通過良好的醫(yī)療技術(shù).2 .使用的樣本要在 56c條件下熱處理1小時.3 .血清或血漿可以在 2-8 C儲存一周.為預(yù)防可能的污染,庫存的樣本如儲存時間超過一周的應(yīng) 該被儲存至冰凍-20 C甚至更低.樣本不要反復(fù)凍融.冰凍的樣本應(yīng)該首先被徹底融化室溫 ,然后充分混勻.如果有必要去掉其中的肉眼可見的顆粒成分,要進行離心.測試之前,樣本要恢復(fù)至 室溫.預(yù)防樣本的反復(fù)凍融.4 .應(yīng)該首選干凈的,非溶血的樣本,有沉淀的樣本要通過離心

23、去除.5 .經(jīng)過測試,以下物質(zhì)對陰性和陽性樣本的反響活性沒有影響：血紅蛋白高至80mg/dl,甘油三酯高達1600 mg/dl ,膽紅素高達 60 mg/dl .多達五次的反復(fù)凍融或者spiked和白色念珠菌,葡萄球菌表皮菌素,假單胞桿菌銅綠菌素最終濃度都達103CFU/mL于2-8 C放置八天都對抗 HCV陰性和陽性樣本反響活性沒有影響.6 .經(jīng)較好醫(yī)療技術(shù)采集的血清被收集在血清別離管或者真空樣本收集管或者血漿,含有EDTA的鉀鹽15%,肝素的鈉鹽,ACDB溶液,CPDA-1,或者4%寧檬酸鈉可以被使用.為了確證樣本抗凝 劑的準確比例,被抽進真空管的樣本應(yīng)該被評估for fill adequ

24、acy基于NCCL礪準或者血液試管制造商的說明書.7 .針對如下樣本,例如尸體的體液包括血清和血漿,胸積液,唾液,尿液,或者非人類樣本還沒有經(jīng)過試驗評價,所以不應(yīng)該被采用.8 .所有的血液樣本應(yīng)該被視作含有可轉(zhuǎn)染媒介存在而操作.推薦所有的血液或血液組分操作應(yīng)于OSHA血源病原體標準一致.如果樣本要被運輸,它們必須遵照聯(lián)邦章程針對運輸材料和運輸模式標以“診斷樣本“感染物質(zhì) /“病原介質(zhì)字樣進行包裹.在一個周圍溫度為30c甚至更低的條件下樣本可以被運輸6天,2-8 C冰冷條件下可以運輸七天,也可以干冰環(huán)境中運輸.預(yù)防樣本的反復(fù)凍融.到達實驗室以后,在周圍溫度環(huán)境中或者2-8 C環(huán)境中運輸?shù)臉颖?假

25、設(shè)它們在一周內(nèi)被測試,所有樣本可以放置 2-8 C保存.被干冰環(huán)境運輸?shù)臉颖緫?yīng)該在一個-20 C甚至更低的不用除冰的冷藏庫中保存,直至它們被用去測試.10.步驟A.提供的材料30人份,產(chǎn)品編號930600每個CHIRONBA HCV3.0 SIA試劑盒包含有以下成分STRIP30個條帶6個袋子SD1瓶100mlCON1瓶65ml4CN1瓶12mlSB1瓶60mlWB1瓶80mlPC1小瓶0.3mlNC1小瓶0.3ml帶蓋洗滌容器-每盒兩個每個試劑盒包含一個最多可以操作6次的足夠量的試劑.見第4局部,對每個提供的試劑都有一個完整的描述B.需要但不提供的材料1 .搖床可分量混合器：能夠維持一個傾斜

26、度在20度-30度之間的每分鐘16-20循環(huán)搖速.2 .能夠維持110 5 rpm轉(zhuǎn)速的旋轉(zhuǎn)搖床.3 .為準備工作洗液緩沖液以洗滌條帶的蒸儲水或去離子水.4 . 一次性手套.5 .確定的或校準過的能夠移去20ul和1000ul的移液裝置,且精密性到達至少土5%6 .干凈的玻璃或者聚丙烯帶有刻度的量筒10ml,25ml,50ml,100ml .7 .血清學(xué)的移液管5ml或者10ml.8 .為處理條帶的金屬或者塑料鐐子.9 .抽氣裝置和維持抽氣狀態(tài)的空間.試驗中的抽出物潛在的具有感染性,丟棄前應(yīng)該被消毒.液體的 次氯酸鈉例如家用消毒劑被 1: 10稀釋在抽出物中,或者等價的其它消毒劑也可以在丟棄前

27、對抽 出物進行消毒.10 .試驗管架和洗滌容器RBA啟動試劑盒,強生臨床診斷公司,產(chǎn)品編號 930590.每個洗滌容器 最多可容20個條帶.C.主要陳述1 .最大的操作數(shù)量是 30個條帶包括陰陽性對照條帶；最少的操作數(shù)量是 3個條帶包含有陰陽性 對照條帶.每個試劑盒包含一個可操作 6次的足夠量的試劑.每次操作必須順利進行,不能有中斷, 正如測驗步驟中指明的那樣.2 .對每一系列的病人或者捐贈者樣本,要測試陰性陽性對照.和病人或捐贈者樣本一樣要準確的處理陰陽性對照.3 .在試驗步驟中使用試劑前,要確認已經(jīng)準備好工作洗液和工作底物的量充足,如果測試過程中發(fā)現(xiàn)上述量缺乏,那么試驗操作被認為是無效的,

28、需要再次準備試劑重復(fù)進行.4 .為預(yù)防褪色,保持操作過程中的條帶避光例如,陽光直射和避熱高于30C.5 .伴隨著試驗步驟的完成,要對洗滌容器用三倍體積的蒸儲水或去離子水進行洗滌.使用六次后洗滌容器可以棄掉.D.試驗步驟1 .開始測試之前大約三十分鐘,從2-8 C拿出試劑盒,并允許試劑盒成分恢復(fù)室溫15-30 C.使用前請溫和搖轉(zhuǎn)容器數(shù)次以徹底混勻試劑.預(yù)防氣泡產(chǎn)生.2 .如果還沒有準備,那么請準備工作洗液見第6局部中表1,試劑準備局部3 .從密封的錫袋中取出所需數(shù)量的條帶,并放置于各自軟管的試驗軟管支架上.一個樣本軟管和陰陽性試劑盒對照軟管是必需的.注意：樣本被測試時,試劑盒供應(yīng)的陰陽性對照每

29、次必須被包含. 開袋后,條帶必須在兩周內(nèi)被使用.不用的條帶應(yīng)該于原先軟管中2-8 C放置,并處于含有枯燥劑的密閉錫袋中.使用膠帶去封閉小袋, 并在小袋標簽上記錄小袋被翻開的日期和小袋的使用期限.4 .根據(jù)樣本確認數(shù)量確定條帶使用的數(shù)量.5 .移去軟管的蓋子,并在每個軟管中加1ml樣本稀釋液保證整個條帶被液體覆蓋.6 .加20ul的適量樣本或者對照到對應(yīng)標記的軟管中.蓋上軟管的蓋子并顛倒混勻.注意：對每份樣本或者對照要使用移液器7 .請把軟管架在搖床上見圖2,并用橡膠帶或膠帶系緊；室溫下15-30 C搖動每分鐘 16-20轉(zhuǎn)4-4.5小時.記錄好樣本孵育步驟的起始時間和終止時間.Figure 2

30、注意：搖床介導(dǎo)的稀釋的樣本或者對照與條帶的反響對到達試驗的最正確性能是非常重要的.整個孵育過程中定期檢查以保證搖床運動是否持續(xù).可能影響到抗體結(jié)合的搖床不正確運行將使測試結(jié)果無效 而且需要重復(fù)進行試驗.8 .翻開軟管的蓋子并完全吸出液體到一個適宜的廢液容器中見第5局部,第6項的警告.每個軟管中加1ml的樣本稀釋液.9 .蓋上軟管,并把軟管支架放到搖床上,室溫15-30 C搖動30-35分鐘,然后再次吸出液體.10 .力口 1 ml工作洗液見表 1到每個軟管中,然后倒液體和條帶到含有10ml工作洗液的洗滌容器中每個洗滌容器最多 20個條帶.如果操作數(shù)量少于 20個條帶,再加工作洗液以補足到30m

31、l.旋轉(zhuǎn)洗滌容器中的條帶.11 .再加30ml的工作洗液總共 60ml,然后傾倒洗液,并保證條帶仍留在洗滌容器中.為了留下條 帶,傾倒時一般溫和地滾動洗滌容器.12 .加30ml工作洗液,旋轉(zhuǎn),再加 30ml工作洗液,然后傾倒洗液并如步驟11描述的那樣保證條帶仍留在洗滌容器中.13 .洗滌容器中的每個條帶要加 1ml結(jié)合物一個洗滌容器最少10ml.14 .室溫條件下15-30 C在一個轉(zhuǎn)速為110 5rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)洗滌容器 9-11分鐘.注意：偶爾要檢查和搖動洗滌容器以預(yù)防條帶聚集堆疊.搖床的循環(huán)運動對試驗的成功是關(guān)鍵的.15 .準備工作底物第 6局部,表2,試劑的準備局部.16 .結(jié)

32、合物孵育完成后,傾倒結(jié)合物.用30ml的工作洗滌液洗條帶,旋轉(zhuǎn),并再加 30ml工作洗液.傾倒洗液并再重復(fù)該操作兩次.17 .洗滌容器中每個條帶加 1ml的工作底物一個洗滌容器最少10ml.18 .室溫條件下15-30 C在一個轉(zhuǎn)速為110 5rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)洗滌容器15-20分鐘.19 .傾倒工作底物,然后通過加60ml的蒸儲水或去離子水旋轉(zhuǎn)洗滌條帶.倒去洗液并再重復(fù)該操作一遍.為了留住條帶,傾倒時一般溫和地滾動洗滌容器.20 .使用鐐子,轉(zhuǎn)移條帶到一個吸水紙上以吸取多余水分.室溫條件下黑暗空氣中枯燥條帶至少30分鐘.3個小時內(nèi)解釋條帶見第 12局部,結(jié)果解釋.注意：為預(yù)防褪色,保持操

33、作過程中的條帶避光例如,陽光直射和避熱高于 30CO11 .質(zhì)量限制程序試劑盒中的試驗對照每次操作都必須被包括,無論測試的樣本數(shù)或條帶數(shù)是多少.注意：一個試劑盒的陰性陽性對照需要每次操作時都包括在內(nèi),但如果操作中不只一個洗滌容器的話 話,沒必要每個洗滌容器中都要陰陽性對照.被覆蓋在條帶上的抗原確認和定位如圖3所示.每個條帶上的兩種水平的人IgG 水平I,低濃度對IgG內(nèi)部對照條帶對照,個體照；水平n,高濃度對照被作為內(nèi)部對照.通過和水平I,水平n人HCVE應(yīng)活性被確定.詳見第 12局部對結(jié)果解釋的描述.IgG ControlLgvgI IIigG Control Level IFigure 3

34、針對試劑盒的陰陽性對照,以下結(jié)果被期望得到：a.在陰性和陽性對照條帶上,內(nèi)部IgG對照水平I和水平n對應(yīng)條帶必須是通過肉眼可以清楚的區(qū)分的.而且IgG對照水平I必須是明顯更淺的比IgG對照水平n.b.相對所有的HCV條帶,陽性對照條帶必須是 2+甚至更高的陽性參看結(jié)果解釋局部.hSOD寸應(yīng)的條帶必須是視覺上更淺的相對IgG對照水平I來說如-或者+/-.c.陰性對照條帶必須對每個 HCVW肉眼判斷要淺于IgG對照水平I的hSO陳帶展示一個對應(yīng).如- 或者+/-如果試劑盒對照不能滿足以上標準的話,這個操作就是無效的,同時應(yīng)該被重新進行.另外,針對所有的病人或捐贈者樣本條帶IgG對照水平I和IgG對

35、照水平n條帶必須是肉眼清楚可辨的,且IgG對照水平I必須更淺相對 IgG對照水平n條帶來說. 如果這個標準不能滿足某個病人或捐 贈者樣本,那么針對這個樣本的試驗必須被重復(fù).注意：如果帶型不完整,或者有任何假象干擾病人或者捐贈者樣本條帶解釋,即使試劑盒的陰性陽性 對照條帶仍然是可解釋的,這個樣本條帶同樣是無效的,試驗應(yīng)該被重復(fù)操作.12 .結(jié)果解釋樣本的抗HC晰性通過比擬條帶上人 IgG 水平I,水平H的條帶強度對照加以確定.抗體確認被通過HCVt上的特異條帶位置而確認.如第 11局部的質(zhì)量限制程序的圖 3所示.根據(jù)內(nèi)部對照IgG條帶的密度,HCV條帶的強度被打分如下：條帶強度得分鼻-彳氐于Ig

36、G對照水平I的帶強度+/-等同于IgG對照水平I的帶強度1 +高于IgG對照水平I的帶弓II度,但低于 IgG對照 水平n的帶強度2+等同于IgG對照水平n的帶強度3+強于IgG對照水平n的帶強度4+陰性,不確定性,陽性解釋是基于呈現(xiàn)在條帶上的反響類型.對于有效操作,以下標準應(yīng)該被用于解 釋：抗原帶型解釋沒有1+或者更高強度反響活性的 HCV呈現(xiàn),或 者,僅僅hSOW呈現(xiàn)1+或者更高強度的反響活性陰性任何單一的1+或者更高強度反響活性的 HCV呈 現(xiàn),或者,hSOD?呈現(xiàn)1+或者更高強度的反響活 性,同時條或多條 HCV呈現(xiàn)1+或者更高強 度的反響活性不確定性至少后兩條HCV帶呈現(xiàn)1+或者更局

37、強度的反響活 性陽性在這個試驗中低于IgG對照水平I 例如+/-就是低于反響活性的cutoff值.一個陽性條帶解釋僅僅可以在hSOD?反響活性不存在的情況下成立例如 -,+/-.一個陽性測試結(jié)果意味著抗 HCV勺存在和目前或者曾經(jīng)有 HCV勺感染.一個不確定性的結(jié)果意味著抗 HCV可能或不可能出現(xiàn),因此是否有HCV感染存在并不能確定.由于任何條帶上病毒編碼抗原的1 +或者更高強度的反響活性是目前或者過去HCVg；染的可能證據(jù),所有不確定性個體應(yīng)該6-12個月以后被重新測定以確認是否有反響活性增加跡象.建議六個月后使用對個體的新鮮抽取樣本進行重測.經(jīng)過許可的抗HCV篩選步驟呈反響活性而 RIBA

38、HCV惠3.0 SIA測定結(jié)果為陰性的不排除 HCV感染 的可能性.在感染早期,抗 HCV水平可能是檢測不到的.偶然情況下,條帶可能有一個深色的背景. 假設(shè)相對于背景IgG水平I和IgG水平II內(nèi)部對照條帶是 可區(qū)分的例如更深于背景,且 IgG水平n的顏色深于IgG水平I,那么這個條帶是可解釋的,而HCV陰性樣且?guī)У膹姸韧鲜鰞?nèi)部對照進行比擬.條帶上沒有一個或者多個抗原對應(yīng)抗體呈現(xiàn)的抗例如-,+/-本,抗原帶可能會比背景顏色更淺,這樣的帶應(yīng)該作為無反響活性解釋.13 .程序的局限性為了獲得最正確結(jié)果,試驗必須嚴格根據(jù)這些說明進行.盡管丙肝病毒是血源 NANB干炎的首要病原介質(zhì),但是也有可能存在

39、 HCV以外的其它NAN%原途 徑.RIBA &HCV3.0 SIA僅限于人血清或血漿中抗HCV的檢測.尸體的體液包括血清和血漿,胸積液,唾液,尿液,或者非人類樣本還沒有經(jīng)過試驗評價,所以不應(yīng)該被采用.14 .預(yù)期結(jié)果RIBAHCV3.0 SIA的性能通過對低危人群,高危人群, NANBH人群的臨床研究加以評價.特異 性通過三種人群予以評價：1來自正常志愿者的血液捐贈,各自在三個血液中央收集并測定；2已經(jīng)通過許可的多抗原篩選系統(tǒng)重復(fù)驗證有反響活性的來自延緩血液捐贈者的庫存樣本；3來自患有肝臟疾病但為非 NANBH病人個體的樣本.靈敏度通過以下樣本被評估：NANBH病人的樣本血清轉(zhuǎn)陽名單；臨床確

40、認的NANBH病人樣本；可獲得 HAHBH的高危人群樣本,例如血友病患者, 長期血透析病人以及靜脈毒品注射者.所有樣本分別用 RIBA蟄HCV 3.0 SIA和RIBAHCV 2.0 SIA平行測試. A.隨機志愿者的捐贈血液反響活性低危人群B.已經(jīng)通過許可的多抗原篩選系統(tǒng)重復(fù)驗證有反響活性的來自延緩血液捐贈者的庫存樣本反響活性C.針對來自其它肝臟疾病患者或者含有高水平免疫球蛋白的個體樣本的特異性研究.D.血清轉(zhuǎn)陽患者的靈敏度.E.急性或慢性NANBH病人的靈敏度.F.高危人群的靈敏度.15 .具體的性能特征A.潛在的干擾物質(zhì)和條件使用抗HC部日性樣本和陰,f羊本通過 RIBAHCV 3.0 SIA對較高水平的甘油三酯,膽紅素,血紅蛋 白影響進行評估.使用白色念珠菌,產(chǎn)表皮菌素葡萄球菌,產(chǎn)銅綠菌素假單胞桿菌最終濃度都達 10 3CFU/mD最為微生物污染菌的影響也分別在第三天,第八天被測評.屢