1、醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解MTT法檢測法檢測(jin c)(jin c)細(xì)胞活力細(xì)胞活力甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解MTT法目的法目的(md)和意義和意義檢測細(xì)胞存活和生長情況檢測細(xì)胞存活和生長情況(qngkung)用于評價(jià)藥物產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用用于評價(jià)藥物產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用第二頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解原理原理(yunl) 四唑鹽（噻唑藍(lán)）是一種能接受氫原子的染料，簡稱四唑鹽（噻唑藍(lán)）是一種能接受氫原子的染料，簡稱MTT 活細(xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的活細(xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT還原還原(

2、hun yun)為難溶為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的紫藍(lán)色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測）能溶解細(xì)胞中的紫藍(lán)色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而反波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而反映細(xì)胞的增殖情況。映細(xì)胞的增殖情況。 在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比結(jié)晶物形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。第三頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解活細(xì)胞(xbo)+MTT琥珀酸脫琥珀

3、酸脫氫酶氫酶紫藍(lán)色結(jié)晶(jijng)物 Formazan第四頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解貼壁細(xì)胞操作步驟貼壁細(xì)胞操作步驟 1. 接種細(xì)胞：用接種細(xì)胞：用0.25%胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化(xiohu)單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含血清單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含血清的培養(yǎng)液配成的培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液單個細(xì)胞懸液，以每孔，以每孔2000-3000個細(xì)胞接種于個細(xì)胞接種于96孔培孔培養(yǎng)板中，每孔體積養(yǎng)板中，每孔體積90 ul。 （邊緣孔用（邊緣孔用PBS或空白培養(yǎng)基填充）。或空白培養(yǎng)基填充）。 2. 培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在孵箱中，在37、5% CO2及飽和及飽

4、和濕度條件下培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（濕度條件下培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板，大約孔平底板，大約12h），加），加入濃度梯度的藥物。原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，每孔加藥入濃度梯度的藥物。原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，每孔加藥10 ul，一般設(shè)，一般設(shè)5個復(fù)孔。個復(fù)孔。 3. 5%CO2，37孵育分別孵育孵育分別孵育24小時后，倒置顯微鏡下觀察。小時后，倒置顯微鏡下觀察。第五頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解 4. 每孔加入每孔加入10ul MTT溶液（溶液（5mg/ml，即，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液

5、，小心用能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖沖2-3遍遍后，再加入含后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。的培養(yǎng)液。 5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。 6. 每孔加入每孔加入100ul二甲基亞砜（置搖床上低速二甲基亞砜（置搖床上低速(d s)振蕩振蕩10min，使結(jié)，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。處測量各孔的吸光值。 7.同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、培、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、培養(yǎng)液、養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）、二甲基亞砜）第六頁，共

6、二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解懸浮懸浮(xunf)細(xì)胞操作步驟細(xì)胞操作步驟：1）將細(xì)胞離心收集后，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度大約）將細(xì)胞離心收集后，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度大約1104/ml，每孔先加細(xì)胞懸液，每孔先加細(xì)胞懸液90ul,相應(yīng)梯度的藥物每孔相應(yīng)梯度的藥物每孔10ul；共；共100ul加入到加入到96孔板（邊緣孔用孔板（邊緣孔用PBS填充）。填充）。每板設(shè)對照。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、每板設(shè)對照。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、培養(yǎng)液、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），、二甲基亞砜），每組設(shè)每組設(shè)5個個復(fù)孔。復(fù)孔。2）置）置37，5%C

7、O2孵育孵育24小時，倒置顯微鏡下觀察。小時，倒置顯微鏡下觀察。3）每孔加入）每孔加入10 ul MTT溶液（溶液（5 mg/ml，即，即0.5%MTT），繼續(xù)），繼續(xù)(jx)培養(yǎng)培養(yǎng)4 h4）每孔加三聯(lián)裂解液（每孔加三聯(lián)裂解液（10gSDS，異丁醇異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用雙蒸水溶解配用雙蒸水溶解配成成100ml）過夜，）過夜， 第二天早晨置搖床上低速振蕩第二天早晨置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm測量各孔的吸光值。測量各孔的吸光值。第七頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解藥物(yow

8、)的配制 濃度 體積(tj) 過濾第八頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解MTT的配制的配制(pizh)MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是(hu sh)黑黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。尤其當(dāng)紙、錫箔紙包住避光以免分解。尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手

9、套有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的配成的MTT需需要無菌，要無菌，MTT對菌很敏感；往對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，因?yàn)闀r間較短孔板加時不避光也沒有關(guān)系，因?yàn)闀r間較短。第九頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解100 %第十頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解公式如下(rxi)： lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應(yīng)率之和Pm:最大陽性反應(yīng)率Pn:最小陽性反應(yīng)率第十一頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解舉例(j l) 藥物濃度(nngd)0.1、0.01、0.00

10、1、0.0001、0.00001、0.000001umol/l，稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 計(jì)算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025第十二頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 1 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。在進(jìn)行在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，對每一種

11、試驗(yàn)前，對每一種細(xì)胞都應(yīng)測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長細(xì)胞都應(yīng)測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線曲線(qxin)，然后確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間。，然后確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間。2 設(shè)空白對照，設(shè)空白對照，與試驗(yàn)平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照與試驗(yàn)平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。最后比色時，以空白孔調(diào)零?？?。最后比色時，以空白孔調(diào)零。 第十三頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解實(shí)驗(yàn)前應(yīng)明確實(shí)驗(yàn)前應(yīng)明確(mngqu)的問題的問題 1.選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，一般情況下，96孔培

12、養(yǎng)板的孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時約有一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時約有105個細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積個細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測其貼壁試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能滿。這樣，才能(cinng)保證保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，

13、太少觀察不到差異。關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。第十四頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解2.藥物濃度的設(shè)定藥物濃度的設(shè)定(sh dn)。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本和時間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。不是藥物的有效濃度和時間。3. 時間點(diǎn)的設(shè)定。時間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時間點(diǎn)的測定在不同時間點(diǎn)的測定OD值，輸入值，輸入excel表，表

14、，最后得到不同時間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲最后得到不同時間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點(diǎn)應(yīng)該就是最線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點(diǎn)應(yīng)該就是最好的時間點(diǎn)（因?yàn)檫@個時候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。好的時間點(diǎn)（因?yàn)檫@個時候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。第十五頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解4.培養(yǎng)時間。培養(yǎng)時間。100ul的培養(yǎng)液對于的培養(yǎng)液對于10的的45次方的增殖次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持期細(xì)胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會由，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向增殖期漸漸趨向

15、G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換換液的。液的。 5.MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。測定細(xì)胞絕對數(shù)。做做MTT時，盡量無菌操作時，盡量無菌操作(cozu)，因?yàn)椋驗(yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致細(xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色比色OD值的升高。值的升高。 第十六頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解 7.實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔調(diào)零孔加培養(yǎng)基、加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加

16、細(xì)胞、培養(yǎng)液、液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。組加入不同濃度的藥物。 8.避免血清干擾。避免血清干擾。用含用含15胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，高胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會的血清物質(zhì)會影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。第十七頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法

17、檢測細(xì)胞活力講解關(guān)于關(guān)于(guny)細(xì)胞的接種細(xì)胞的接種(鋪板鋪板) 細(xì)胞過了細(xì)胞過了30代以后就不要用了代以后就不要用了;培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板），不培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗(yàn)。好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗(yàn)。 接種時最好按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出的密度接種時最好按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出的密度(md)接種接種, 且而細(xì)胞過密或者且而細(xì)胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細(xì)胞密度多采用細(xì)胞密度多采用10000/ml，100ul/孔?？?。 細(xì)胞密度要根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)來定。細(xì)胞密度要

18、根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)來定。 懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)可達(dá)到可達(dá)到105,貼壁細(xì)胞可為貼壁細(xì)胞可為103-104。第十八頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解 MTT本身就是比較粗的實(shí)驗(yàn)，增殖率本身就是比較粗的實(shí)驗(yàn)，增殖率10%左右的波動都不算左右的波動都不算(b sun)奇怪。特別是新手，奇怪。特別是新手，20的波動也是常見的，所以很可能是的波動也是常見的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過關(guān)種板技術(shù)一定要過關(guān)。 注意注意細(xì)胞懸液一定要混勻細(xì)胞懸液一定要混勻，已避免細(xì)胞沉淀下來，導(dǎo)致每孔中，已避免細(xì)胞沉淀下來，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不

19、等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。另外，吹散次數(shù)過多也會影作要熟練，盡量避免人為誤差。另外，吹散次數(shù)過多也會影響細(xì)胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。響細(xì)胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。第十九頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解如何如何(rh)清除上清清除上清 直接吸出：直接吸出：加加DMSO前要把液體吸掉，但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會吸前要把液體吸掉，但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會吸去，可在這之前先用平板離心機(jī)離心去，可在這之前先用平板離心機(jī)離心96孔板，孔板，2000r，5分鐘，然后吸掉上分鐘，然后吸掉

20、上清清(如果如果(rgu)是懸浮細(xì)胞，則推薦此法是懸浮細(xì)胞，則推薦此法,懸浮細(xì)胞要離心懸浮細(xì)胞要離心2500rpm10min.且其做且其做MTT最好用圓底型最好用圓底型96孔板孔板,清除上清時注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸清除上清時注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉掉,建議各孔吸棄建議各孔吸棄150-160ul即可即可)。 翻轉(zhuǎn)倒扣法：翻轉(zhuǎn)倒扣法：可以直接將板翻轉(zhuǎn)倒扣（墊幾層濾紙）可以直接將板翻轉(zhuǎn)倒扣（墊幾層濾紙）23次，比用次，比用“吸吸”的的辦法更不容易使細(xì)胞脫離出來。可以輕拍，或者傾斜一點(diǎn)幫助吸液，但前提是細(xì)胞辦法更不容易使細(xì)胞脫離出來?？梢暂p拍，或者傾斜一點(diǎn)幫助吸液，但前提是細(xì)胞貼壁要比較牢。貼

21、壁要比較牢。第二十頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解加入加入(jir)DMSO在同一批實(shí)驗(yàn)在同一批實(shí)驗(yàn)(shyn)中最好不要更換中最好不要更換DMSO。加加DMSO前把孔中液體盡量棄前把孔中液體盡量棄干凈如果培養(yǎng)液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養(yǎng)液，這樣在檢測干凈如果培養(yǎng)液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養(yǎng)液，這樣在檢測時可以盡量去除培養(yǎng)液的影響，時可以盡量去除培養(yǎng)液的影響，DMSO的量也可為的量也可為100ul或或150ul.加了加了DMSO后用振蕩器輕輕振蕩后用振蕩器輕輕振蕩510min, 時間控制盡量嚴(yán)格一點(diǎn)時間控制盡量嚴(yán)格一點(diǎn),放置時間放置時間長了會影響結(jié)果長了會影響結(jié)果,值會偏大值會偏大,且結(jié)果不可信且結(jié)果不可信.加入加入DMSO溶解后盡快檢測。溶解后盡快檢測。第二十一頁，共二十四頁。醫(yī)學(xué)專題MTT法檢測細(xì)胞活力講解OD值的測定值的測定(cdng)至于測定波長至于