1、進展述評氏學與哲學(峪床快多論飪版)2011年8月第32卷第8期0第435期艱難梭菌疫苗研究的現狀與展望*楊曉強陳學清摘要：艱難墳菌是引起偽膜性腸炎的致病菌。目杵國內外均出現了同時耐兩種主要治療藥物一甲硝哇、萬古霉素的菌株.疫苗研究是防治艱難梭黃的重要手段。國外研制艱難校菌疫苗近20年，取得了一定進展，本文將對現有的艱雙枚菌疫苗的研究現狀進行總詁，并對疫苗的發展進行展望。關詞：艱難校菌，偽膜性腸炎，疫苗中圖分類號:R378.8文獻標識碼：A文章編號：1002-0772(2011)08-0038-03CurrentSituationandFutureDevelopmentoftheVaccine

2、againstClostridiumDifficileYANGXiao-qiang,CHENXue-qing.GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommandofPLA,Guangzhou510010,ChinaAbstractClostridiumdifficile(CD)isthepathogenofpseudomembranouscolitis(PMC).MetronidazoleandVancomycinarethemajortreatmentdrugsforPMC.However,clostridiumdifficilehasbeenfoundtop

3、ossessmultipleantibioticresistantgenesandclostridiumdifficileclinicalisolatesresistanttobothVancomycinandMetronidazolehavebeenreported,whichincreasethedifficultyfortreatmentofclostridiumdifficileinthefuture.Forallthesereasons,thestudyofvaccineagainstCDisveryimportant.Thevaccinesagainstclostridiumdif

4、ficilehavebeenstudiedinabroadforalmost20yearsandgreatprogresshasbeenachievedinthestudyofclostridiumdifficilevaccine.Inthisarticlewewillhaveareviewoftheclostridiumdifficilevaccine.KeyWords:clostridiumdifficile,pseudomembranouscolitis,vaccine艱難梭菌(clostridiumdifficile,CD)是一種革蘭陽性厭氧芽抱桿笛，臨床上約10%20%的抗生素相關性

5、腹瀉(antibioticassociateddiarrhea,AAD)和100%的偽膜性腸炎(pseudomembranouscolitis,PMC)與此菌有關PMC主要發生于長期服用抗生素者，及其他影響腸道正常菌群，降低抵抗艱難梭菌定殖的情形，如用抗腫瘤藥物、長期住院、免疫缺陷等，特別是那些有免疫功能降低者和/或老年人患者有腹瀉、痙攣性腹痛，飯瀉多為水樣，次數不定，伴里急后重，常伴有惡心、嘔吐、發熱、寒戰、脫水和低血壓.腸鏡下可見特征性的黃白色隆起斑塊(假膜)，直徑2mm5mm,分布于黏膜表面.重癥患者預后差，病死率高達40%口幻。甲硝嘍及萬古篝素是治療的主要手段，但停藥后易復發，且目前國

6、內外均已出現了多重耐藥菌株感染U-婦。疫苗正是防治CD感染的最理想的途徑和方法“:。1CD致病因素及疫苗基礎艱難梭菌主要產生兩種毒素毒素和B毒素。B毒素與A毒素基因有一定的同源性.兩基因位于C端的重復序列，起結合膜受體作用.N端序列為毒素的酶及毒性作用區。現已證實A毒素的C一末端在毒素作用機制中有著非常重要的作用.A毒素作用的靶細胞表面通常存在Galal-3Galp-4GlcNAc結構而A毒素上也有與之想對應的粘合區域。A毒素分子表面結構的大部分是由C-末端重復單位構成的，構成了A毒素分子的粘合區域.B毒素基因的三個氨基酸片段(aal900aa9011750,aal7512366)中，aal7

7、51-2366(CDB3)具有良好的抗原性。實廣州軍區廣州總醫院消化內科廣東廣州510010 廣州醫學院第一附屬醫院消化內科廣東廣州510120*基金項目：國家自然科學基金自由申請面上項目.項目編號：30570839;廣東省自然科學基金.項目編號：05004735;廣東省教育部產學研結合項目，項目編號,20098090300354驗發現，只有抗受體結合區域的抗體(抗CDB3抗體)才能保護細胞免受B毒素的細胞毒性戚-8：。因而艱難梭菌的疫苗研究也主要集中在研究A毒素與B毒素的C端的重復序列上.2艱難梭菌疫苗研究技術的種類2.1被動免疫型疫苗Kink等A用艱難梭弟菌體經甲酸處理后免疫母雞，得到蛋黃

8、免疫球蛋白IgY,經純化后，口服治療艱難梭笛感染的敘利亞倉鼠。感染后24小時口服的存活率為86%,48小時口服的存活率為57%,而對照組則無一存活。他們同時通過基因克隆重組和在大腸桿菌內表達A毒素和毒素B片段，經純化后免疫WhiteLeghorn母雞，得到蛋黃免疫球蛋白IgY,O服治療艱難梭幽感染的雌性敘利亞倉鼠，發現重組A毒素片段pMA18702680能有效防止倉鼠死亡和腹瀉.使用弗氏佐劑的毒素B片段PMB17502360免疫母雞得到的親和純化的1.5mg抗體在活體內中和毒素B.而使用Gerbu佐劑免疫母雞的親和純化抗體300昭在體內能完全中和毒素B.并將pMA18702680與PMB175

9、02360免疫母雞得到的IgY經純化后制成凍干粉.包裹腸衣，構成重組A毒素毒素B抗體,能中和毒素，可有效地保護倉鼠，治愈CDAD.作者在美國、歐洲各國、巴西及中國申清了專利，并獲得了專利權.這一類型疫苗的優點是不僅可預防，還可以作為治療性疫苗，但成本高，保存運輸不便。2.2主動免疫型疫苗2.2.1減毒疫苗：lbrres等將艱難梭菌產毒株培養濾液及菌體分別用福爾馬林滅活后.以震亂毒素作為黏膜佐劑，經黏膜途徑鼻內、骨內和直腸)或腹腔、皮下等途徑免疫倉鼠.鼻內免疫或腹腔內重復免疫可完全預防倉鼠死亡和腹瀉發生.Giannasca等將滅活的艱難梭菌毒素采用腸外免疫結合黏膜免疫的方法免疫倉鼠.結果發現經直

10、腸聯合肌注接種可保護倉幽免于死亡及發生腹瀉，保護作用與倉鼠血清中產生的中和性抗體有關，沒有佐劑肌注接種產生最大的保護,這種方法產生最高的血清抗B毒素抗體及B毒素中和滴度。Kotloff等明將艱難梭菌分泌的毒素純化后，經福爾馬林處理后分4次腸外免疫30名健康成年志愿者。結果幾乎所有受試者均發生了強烈的血清抗體反應.不良反應僅為輕微的腹痛及關節痛。Aboudola等將艱難梭菌類毒素經腸外免疫30名健康成年志愿者，受試者血清中均產生了高濃度的抗艱難梭菌A毒素】gG,接種結束時受試者血清中的抗艱難梭菌A毒素IgG濃度超過了起臨床保護作用的濃度，提示采用類毒素為疫苗保護艱難梭曲相關性腹瀉與腸炎高危患者是

11、可行的。Sougioultzis等用甲醛滅活得到的艱難梭菌毒素A及毒素B的類毒素對3位反復復發CDAD患者進行接種，這3位患者分別在7、9、22個月內連續使用萬古霉素以治療反復發作的CDAD,其中兩位患者還使用過消膽胺、桿菌肽、生態菌制劑以及免疫球蛋白等治療，但停藥少于1周即發生腹瀉，糞便培養及細胞毒性實驗證實為復發性CDAD,接種在第0,7,28,56夭進行，以4悠，50昭三角肌內注射，所有患者于第四次接種后停用萬古霉素,在接種后的半年里，患者未再接受萬古卷素治療,亦未有CDAD復發，三位患者中除一位因接種得了風濕性多肌痛外，其余兩位患者僅有短暫且輕微的頭痛、輕微腹痛及大便習慣改變。2.2.

12、2基因重組疫苗:Pavliakova等停)通過基因重組表達用艱難梭菌A毒素蔑基端重復單位作為載體蛋白與其他病源微生物的多埔共價結合，構建成疫苗，能墀誘導T細胞依賴性反應及產生抗體，可以保護小鼠免受這些病源微生物及艱難梭菌的侵害。Zheng等采用基因重組技術，在大腸桿菌內表達A毒素與毒素B基因的3端的重復序列，重組多肽純化后與多糖結合免疫小鼠,可以保護經腹腔注入致死劑量A毒素及毒素B的小鼠免于死亡.此外，他們還將A毒素的EcoRI醇切基因片段(55306577bp)與毒素B的Apol酶基因片段(54646180bp)連接形成1763bp融合基因，此基因編碼PCG-4抗原表位.可以用于治療艱難梭鑿

13、引起的疾病.他們于2000年取得了美國專利。雖然這類疫苗也有較好的效果，但由于采用福爾馬林處理抗原.或免疫時配合使用佐劑，一些采用侵入性免疫途徑(如皮下、腹腔內注射等)，因此，人體應用時不易被患者接受.2.3口服活函疫苗口服活薄疫苗也是主動免疫型疫苗的一種。Ryan等購用PETR14質粒，以大腸桿菌分泌型溶血素A信號肽作為信號肽，在減毒霍亂孤幽中表達艱難梭菌A毒素梭基端無毒的受體結合區。口服重組波毒霍亂弧鑿后，家兔接種后5天在回腸仍有重組菌的定植。口服免疫可產生高滴度的抗A毒素抗體IgG及抗霍亂孤菌抗體，并有力地保護艱難梭菌A毒素對【可腸岸的攻擊。Ward等將艱難梭菌A毒素歿基末端重復序列(1

14、4CDTA)與無毒的破傷風毒素C片段(TETC)基因構建重祖融合蛋白表達質粒，在減毒鼠傷寒桿菌中表達，形成減毒活菌疫苗，通過鼻腔及胃飼活菌，在肺、腸愁膜和血清中產生高滴度的抗A毒素抗體及抗破傷風毒素抗體。增加菌最或皮下注射純化重組14CDTA多肽.可增加抗體滴度，活圉免疫的小鼠血清可中和艱難梭菌A毒素細胞毒性。此活菌疫苗可預防艱難梭菌、破傷風和傷寒菌的感染。活菌疫苗的優點是經濟、方便，也有較好的免疫保護效果，還可同時做成多介疫苗，但由于目前采用了減毒傷寒函或霍亂孤菌作為載體菌，于人體應用時其生物安生性值得關注，因而有進一步改進的必要。Permpoonpatuna等以枯草桿菌芽弛為載體表達艱難梭

15、菌A毒素與B毒素段基未端重復序列，通過口服枯草桿萌芽抱治療蠢整蓄研究的現狀與眼等炭學與哲學(臨床決策論定版)2011年8月奶32卷第8期母第435期艱難梭萌倉鼠感染模型，發現針對A毒素核基未端重復序列產生的分泌性抗體可與B毒素的類似區域發生交叉反應且具有高的親合力，所產生的黏膜免疫能有效地治療同時產生A毒素與B毒素的艱難梭菌感染，并預防再感染及復發。認為研究艱難梭菌疫苗可圍繞黏膜免疫及A毒素重復區域展開。2.4DNA疫苗Gardiner等弒合成編碼艱難梭萌A毒素受體結合區的基因，構建其真核表達質粒，并使其在人細胞中最佳表達,體外檢測表達地.采用非腸道途徑接種表達質粒，繼而以A毒素攻擊接種的小鼠

16、，接種重組質粒的小鼠產生高滴度的抗艱鹿梭菌A毒素抗體，且能保護腹腔注射致死劑最A毒素的小鼠免于死亡。3疫苗研究的展望盡管艱難梭菌疫苗的研究已近20年，目前尚未有可用于人體的疫苗正式上市,一項標簽公開、劑量按比例上升的臨床I期試驗:顯示健康志愿者接受人抗艱難梭菌A毒素單克隆抗體后無嚴重不良反應，只有一些如無需處理的暫時性血壓改變、鼻充血、頭痛、腹部痙攣痛、惡心、自限性腹瀉等不良反應，隨著接種劑敏的增加血清人抗艱難梭苗A毒素單克隆抗體濃度增加，所有志愿者均未檢測出人抗人抗體。隨后進行的一項關于浪難梭菌A毒素單克隆抗體及B毒素單克隆抗體聯合防治CDAD的隨機、雙盲、安慰劑對照II期研究顯示聯合使用A

17、毒素與B毒素單克隆抗體可有效地預防CDAD的復發。除了目前已應用于人體的單克隆抗體疫苗、類毒素疫苗外，一些針對A毒素與B毒素受體結合區的基因重組疫苗在動物實驗中取得了良好的防治效果，若果用生態菌表達A毒素與B毒素受體結合區,其生物安全性及有效均較高.是開發艱難梭菌疫苗的一個重要方向。隨著艱難梭菌疫苗研究的不斷深入，相信在不遠的將來，這一嚴重危害人類健康、造成巨大社會經濟負擔的疾病一定會被人類征服。參考文獻1 王勇，劉新光.避辨枚菌性腸炎J.國外醫學消化分冊，2003,96(2):96.2 劉楊.艱難梭菌相關性腹瀉的治療和預防J.中國抗感染化療雜志,2001,1(2),125.3 McFarla

18、ndLV.SurawiczCM,RubinM,etal.Recurrentclos-tridiumdifficiledisease：epidemiologyandclinicalcharacteristicsJj.InfectControlHospEpidemiol199920(1)：4350.4 JohnsonS,GerdingDN.Clostridiumdifficile-associateddiarrheaJ.ClinInfectDis.1998.26(5),1027-1034.5 RieglerM,SedivyR.PothoulakisCetal.Clostridiumdifficil

19、etoxinBismorepotentthantoxinAindamaginghumancolonicepitheliuminvitrofj.JClinInvest199595:20042011.6 WardSJ.EteuceG.FigueiredoD.ctaLImmunogenicityofaSalmonellatypWmuriumaroAaroDvaedneexpressinganontoxicdomainofClostridiumdifficiletoxinJJ.InfectImmun,1999.67(5)：2】452152.7 HofmannF,BuschCPrepensUctal.L

20、ocalizationofthegiucosyitrara-feraseactivityofClostridiumdifficiletoxinBtotheNterminalpartoftheholotoxinJ.JBiolChcm,1997.272(17)：1107411078.8 GenthH,SehcrJ,BuschC,etal.NewmethodtogenerateenzymaticallydeficientClostridiumdifficiletoxinBasanantigenforim-munizationJ.InfectImmun,2000,68(3：1O94-1101.9 Ki

21、nkJAWilliamsJA.AntibodiestorecombinantClostridiumdifficiletoxinsAandBarcaneffectivetreatmentandpreventrelapseofC.difficileassociateddiseaseinahamstermodelofinfectionJj.InfectImmun,1998,66120182025.艱MS研究的現狀與展88楊岐強等底學與哲孕(棉床決策論壇版)20。年8月第32卷第8期0第前5期】0iJamesAW,SongerJG.Hencrryolkantibodiestodostridiumdif

22、ficileantigensanduseintherapyforpseudomembranouscolitisCP.(TheArizonaboardofregentsonbehalfofUniversityofArizona,USA)PCTInt.Appl.WO9902,188(CUA61k39/395)2】Jan1999USAppl.52312,11,)997,42.illTorresJF.LyerlyDM,HillJE.etal.Evaluationofformalininactivateddostridiumdifficilevaccinesadministeredbyparentera

23、landmucosalroutesofimmunizationinhamstersJ.InfectImmun,1995,63(12):4619-4627.12GiannascaPJ,ZhangZX.LeiWD.etal.SerumantitoxinantibodiesmediatesystemicandmucosalprotectionfromClostridiumdifficilediseaseinhamstcrsCJ.InfectImmun,1999,67(2)：527538.13iKotloffKL.WassermanSSJaonskyGA.etal.Safetyandimmunogen

24、icityofincreasingdosesofaClostridiumdifficiletoxoidvaedneadministeredtohealthyadultsfj.Infectlmmun,2001,69(2)(988995.14 AboudolaS.KotloffKL,KyneL,etal.ClostridiumdifficilevaccineandserumimmunoglobulinGantibodyresponsetotoxinAJ?.InfectImmun,2003,71(3)：16081610.15 SougiltzisS.KyncL,DrudyD.etal.Clostri

25、diumdifficiletoxoidvaccineinrecurrentC.difficileassociateddiarrheaj.Gastroenterology.2005,128(3)764-770.16 PavliakovaD,MoncriefJS.LyerlyDM,etal.ClostridiumdifficilerecombinanttoxinArepeatingunitsasacarrierproteinforconjugatevaccines：studiesofpneumococcaltype14,EscherichiacoliKI,andShigellaflexnerity

26、pe2apolysaccharidestnmiceJ.InfectImmun,2000,68(4):2161-2166.17 ZhengLimin.Wilkins.TracyDetal.RecombinanttoxinA/toxin(上接第20頁)所以說，膠囊內鏡檢查應后于電子肯鏡以及電子結腸鏡.既避免了上述并發癥的出現.亦可避免對膠囊內鏡的溫用。膠囊內鏡滯留間題解決的前提是及時發現問題.這就要求檢查醫生要隨時觀察、加強監控，明確了解膠囊運行位置以做出合理判斷及處置。一旦出現膠囊內鏡的小腸內滯留，如果患者病情尚無手術適應證，則可嘗試進行單氣囊或者雙氣囊推進式小腸鏡將膠囊取出,而若病情復雜，常規

27、電子胃鏡、腸鏡或者小腸鏡均無法將滯留膠囊取出的話.則常常需要外科手術的幫助.隨著生產廠家技術的進步及質景的改善，目前產品穩定性有了長足的發展，檢查者的經驗提升，表明機械故障隨著時間推移會越來越少.統計顯示，在膠囊產品質量:方面,第1年2枚無法啟動.第2年、第3年各1枚，忌故障率為2.1%,此后未再出現上述情況，也證明了產品質最的提升以及產品生產管理的跟進。由于產品的不均一性.導致每個智能膠囊實際工作時間有長有短，而不同患者間消化道情況也差別很大.因此我們要隨時監測膠囊運行狀態以及腸段圖像，力爭在膠爨乏電前完成小腸檢查，以免漏診。總之，膠囊內鏡是一項涉及醫學、光學、電子學等各項技術高度交叉的設備，對操作醫生的常規內鏡基礎、膠囊內鏡診斷技巧與操作技巧均有很高要求。雖然其檢查中會遇到這樣或那樣一些問題.但只要醫生進行檢查前仔細評估以及檢查中持續的定期監測，并隨時作出針對性處理.會讓膠囊內鏡檢查的風險以及給醫患雙方造成的困擾降到最低.參考文獻I1IddanGMeronG