1、豬病診斷技術標準一、致病性大腸桿菌的檢測1 引用標準參考NY/T 555-2002動物產品大腸桿菌、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢測方法。2 范圍適用于豬大腸桿菌病的診斷。3 檢測方法3.1 材料 營養肉湯 營養瓊脂 EMB TSI IMViC生化鑒定管 小白鼠3.2 別離培養a) 將采集的肝、脾、心血或腸內容物等分別接種伊紅美蘭瓊脂平板同時接種營養肉湯增菌備用，置37 培養1824 h。b) 觀察培養特性，挑取黑色有金屬光澤的菌落，用該菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢。c) 如可見到兩端鈍圓并多以單個存在的革蘭氏陰性粗短桿菌，應取510個典型菌落再接種于TSI瓊脂。d) 同時挑取典型菌落接種營養瓊脂，3

2、7 培養1618 h的菌液用于生化特性鑒定。3.3 生化鑒定挑取上述菌落純培養物接種以下生化培養基和乳糖發酵管，(36±1) 培養24 h后觀察結果。 靛基質試驗：a) 滴加Kovacs氏靛基質試劑0.1 mL于靛基質試驗培養基中混合，觀察結果。b) 出現紅色環的為反響陽性；出現黃色環的為反響陰性。 甲基紅MR試驗a) 滴加甲基紅指示劑0.2 mL于MR-VP培養基中混合，觀察結果。b) 出現紅色為陽性反響；出現黃色為陰性反響。3.3.3 VP試驗a) 滴加VP試劑甲液0.2 mL于MR-VP培養基中混勻，再滴加VP試劑乙液0.1 mL混勻，靜置，觀察結果。b) 在15 min內出現

3、紅色的為陽性反響；無顏色變化的為陰性反響。陰性結果1 h后再觀察一次，出現紅色也為陽性反響。 枸櫞酸鹽試驗：觀察培養基顏色變化，出現藍色為陽性反響；不變色為陰性反響。3.4 大腸桿菌鑒定結果應符合表1要求。表1 大腸桿菌鑒定結果靛基質MRVP枸櫞酸鹽鑒定+-典型大腸埃希氏桿菌-+-非典型大腸埃希氏桿菌+-+典型檸檬酸鹽桿菌-+-+非典型檸檬酸鹽桿菌-+典型產氣桿菌+-+非典型產氣桿菌出現表1的生化反響類型時，如果為組織樣品，由此可初步報告為致病性大腸桿菌。如果為糞便，尿液，飼料，飲水，應進一步做致病性試驗。3.4 致病性試驗a) 取經營養肉湯37 培養1618 h后的純化菌株培養液，分別腹腔接

4、種體重20g左右的小白鼠，每株接種23只，每只0.3 mL含菌量約為1×1012 cfumL，同時用一樣數量的小白鼠接種無菌肉湯作對照。b) 飼養觀察、記錄死亡數，并從死亡鼠的心、肝中回收接種菌。在24小時內出現死亡的可報告為致病性大腸桿菌。4 藥敏試驗a) 挑選瓊脂平板上典型菌落接種營養肉湯培養中，37 培養1618 h，菌液用于藥敏試驗。b) 將肉湯培養物用標準比濁管比擬達一樣濁度稀釋至含菌量為1×109 cfumL，搖勻后蘸取菌懸液均勻涂布于瓊脂平板上，然后用無菌鑷子將藥敏片貼附其上，每紙片25張，置37 培養24 后觀察。c) 根據抑菌圈大小來判定其對藥物的耐受性，

5、選擇敏感藥物。二、沙門氏菌的檢測1 引用標準 參考NY/T 550-2002動物和動物產品沙門氏菌檢測方法。2 范圍適用于豬沙門氏菌病的診斷。3 檢測方法3.1 材料 SC DHL TSI 賴氨酸脫羧酶LD 鄰-硝基酚-D-半乳糖苷DNPG 甘露醇糖發酵管3.2別離培養a) 采集疑似病例的肝、脾、心血或腸內容物樣品。b) 無菌剪取肝、脾樣品1 g，投入10 mL SC增菌液中血液、糞便樣品可以采適量直接投入10 mL增菌液，36±1 培養1824 h。c) 取一接種環增菌液劃線接種于DHL瓊脂平板上，36±1 培養1824 h。觀察平板上菌落生長形態。沙門氏菌在DHL平板上

6、呈無色半透明，產硫化氫H2S，菌落中心黑色或幾乎全黑色。3.3 生化鑒定a) 挑取DHL平板上可疑菌落35個，每個菌落先洗入TSI培養基冷凝水中，繼而在斜面上劃線接種并高層穿刺接種。b) 再挑取同一菌落依次接種氨基酸脫羧酶發酵試驗LD和ONPG，甘露醇糖發酵管三支生化管，假設菌落偏小，二次挑取菌落有困難，可用接種環醮取TSI培養基中冷凝水接種其余生化管，36±1 培養1824 h挑取菌落后的平板，應置于4 冰箱保存48 h以備復查。c) 按表1記錄反響結果，對照表2進展判定。d) 凡符合表2生化反響模式，可報告為沙門氏菌。表1 生化反響結果判定生化管TSILDONPGMAN底a斜面b

7、硫化氫第一次顏色記錄符合黃+黃+黑+紫+深黃+黃+第二次顏色記錄符號紅-紅-無黑色-黃-無色或淡黃-紫-a “底觀察葡萄糖反響。b “斜面觀察乳糖和蔗糖反響。表2 生化檢測沙門氏菌屬判定表序號TSILDONPGMAN判定底斜面硫化氫ABaCDbEcFdG+-+-+-+-+-+-+-+-+-沙門氏菌亞種、沙門氏菌亞種b、15a沙門氏菌亞種a、15b、15少數沙門氏菌亞種少數沙門氏菌亞種甲型副傷寒沙門氏菌非沙門氏菌a含1硫化氫陽性的大腸埃希氏菌，可加試靛基質加以鑒別，其中大腸桿菌陽性，沙門氏菌陰性。b賴氨酸陰性的沙門氏菌主要有：甲型副傷寒、傷寒、豬霍亂沙門氏菌孔成道夫變種、雞等。c 硫化氫陰性的沙

8、門氏菌主要有：甲型副傷寒、傷寒、豬霍亂、豬傷寒、仙臺、貝塔、巴布亞、雞、馬流產、山夫登堡、都柏林登。d可直接用O單因子血清證實，以排除雷極氏普羅菲登斯菌登。4 藥敏試驗a) 挑選DHL平板上典型菌落接種營養肉湯培養中，36±1 培養1618 h，菌液用于藥敏試驗。b) 將肉湯培養物用標準比濁管比擬達一樣濁度稀釋至含菌量為1×109 cfumL，搖勻后蘸取菌懸液均勻涂布于瓊脂平板上，然后用無菌鑷子將藥敏片貼附其上，每紙片25張，置36±1 培養24 后觀察。c) 根據抑菌圈大小來判定其對藥物的耐受性，選擇敏感藥物。三、產氣莢膜梭菌的檢測1 引用標準 自定標準。2 范

9、圍適用于豬產氣莢膜梭菌病的診斷。3 材料3.1 綿羊血瓊脂3.2 牛乳培養基。4 組織染色鏡檢對疑似病例的腸道黏膜涂片，魏氏梭菌呈G+，直桿狀，兩端鈍圓，單在或成雙，無鞭毛，不運動。芽孢大而卵圓，位于菌體中央或近端，多數菌株可形成莢膜。5 別離培養可將腸道內容物接種血平板，37 厭氧培養1824 h后觀察。菌落特點：魏氏梭菌在血平板上可形成直徑25 mm、圓形、邊緣整齊、灰色至灰黃色、外表光滑半透明、圓屋頂狀菌落，有雙層溶血環?？赏ㄟ^鏡檢對形態進一步確定。6 生化鑒定對牛乳培養基的“暴烈發酵。7 腸內毒素檢查采集空腸后段或結腸前段內容物，加適量生理鹽水稀釋，經離心沉淀后取上清液分成兩份，一份加

10、熱60 30min。兩份上清液分別靜脈注射家兔13ml或小鼠0.10.3ml。如有毒素存在，不加熱組動物常于數分鐘至數小時內死亡，而加熱組動物不死亡。8 報告因為正常人畜腸道內存在此菌，并且發病菌主要靠在腸道內產生毒素致病，細菌本身并不侵入機體。因此只有細菌別離和腸毒素檢查都符合，并結合臨床病癥才能報告產氣莢膜梭菌感染。鑒別A型和C型要靠中和保護試驗。四、豬痢疾診斷1 引用標準參考NY/T 545-2002。2 范圍適用于豬痢疾SD的實驗室診斷。3 糞便中Sh顯微鏡檢查3.1 材料 器材：顯微鏡，暗視野鏡頭，玻片及蓋玻片，酒精燈等 染色液：結晶紫染色液或稀釋的石炭酸復紅。 樣品：病豬新鮮糞便含

11、粘或直腸拭子或大腸內容物及黏膜3.2 操作方法 染色樣品制作：取樣品直接抹片，枯燥，火焰固定，以1.2.2結晶紫液或稀釋復紅染色2 min3 min，水洗，吸干后待檢。 懸滴樣品制作：取樣品少許懸于生理鹽水，待檢。每份樣品最少制片2張 顯微鏡檢查：染色樣品以油鏡直接觀察，懸滴樣品在暗視野4001000倍鏡頭下觀察。3.3 結果判定典型Sh菌體長6 m8.5 m，呈25個密螺旋體，兩端鋒利，呈蛇樣活潑運動。當視野中有數量35條以上Sh樣菌體時，在獲培養前，可作為診斷的重要參考。4 別離培養和鑒定4.1 材料準備 器材：厭氧培養裝置及使用方法，細菌學實驗常規器材，外科手術器材，微孔濾器和0.65

12、m濾膜。 試驗動物：小鼠20 g左右 試劑：PBS(0.01M，pH7.2)，生理鹽水，多粘菌素，TSA。 樣品：病豬新鮮糞便或大腸粘膜刮取物含粘液。對死豬或撲殺豬大腸分段結扎每段10cm，別離取出。樣品應盡早別離培養，也可04 保存47 d。4.2 操作方法 樣品種Sh鏡檢將樣品少許摸片染色或作成懸滴標本，鏡檢，觀察Sh有無活力。含菌量少且無活力者，那么難以別離成功。 別離培養.1 直接劃線別離法：即取樣品直接在TSA上劃線接種假設干皿。.2 集菌法：先將樣品以生理鹽水或PBS作1：5稀釋，2000 r/min，棄去沉淀。將上清液再以60008000 r/min離心20 min。取沉淀劃線接

13、種TSA假設干皿。.3 稀釋法：將樣品或集菌法的沉淀物作10倍梯度稀釋至10-610-8。取各梯度稀釋液各1滴，分別劃線接種于TSA上，每梯度稀釋液最少接種3皿。接種后的培養皿置厭氧罐內進展厭氧培養。假設上述稀釋液中參加多粘菌素200 U/mL300 U/mL，可提高別離率。4.3 結果判定 觀察每隔24 d開罐檢查一次，共24次，觀察有無溶血區及溶血菌落。致病性Sh呈強溶血，一般看不見菌落。當培養條件適宜時，再溶血區可見到云霧狀菌苔。無害蛇樣螺旋體等呈弱溶血。 移植純化先作溶血區內物質涂片，染色鏡檢。如見Sh樣菌體，可在無菌落溶血區內移取小塊瓊脂劃線于TSA假設干皿。如此每隔2天移植一次，一

14、般24次后即可純化和保存。豬蛇樣螺旋體鑒定.1 溶血試驗將豬蛇樣螺旋體、無害蛇樣螺旋體或毛腸蛇樣螺旋體及被檢菌株，分別劃線于同一TSA上不同區內，經48 h培養后，觀察比擬其溶血程度。.2 腸致病性試驗每菌株至少接種6只小鼠，將小鼠停飼24 h后，每只每次灌服1 mL含菌35億，次日再灌服一次，15 d后剖檢觀察盲腸病變。感染后50出現腹瀉和病變者，那么為致病性Sh。五、豬巴氏桿菌病診斷技術1 引用標準參考NY/T 564-2002。2 范圍適用于豬巴氏桿菌病的檢測。3 材料3.1 改進馬丁氏瓊脂3.2 馬丁氏肉湯3.3 常用生化培養基。4 組織染色鏡檢用肝臟組織或心血摸片或純培養物染色呈陰性

15、，瑞氏染色呈兩極濃染的球桿菌。5 病原別離鑒定將瀕死前或死后數小時內以無菌手術采取病死豬的心血、肝臟組織，接種于改進馬丁氏瓊脂斜面，進展別離。培養1824 h后，改進馬丁瓊脂斜面生長純粹的培養物，呈微藍色菌臺或菌落。馬丁肉湯培養物生長為均勻渾濁，不產生菌膜。6 生化鑒定本菌發酵葡萄糖、果糖、半乳糖，多數發酵蔗糖，不發酵乳糖、肌醇、菊糖、水楊素及鼠李糖，吲哚試驗和氧化酶試驗陽性。7 診斷判定根據臨床病癥和病理變化，加上涂片染色鏡檢，可對本病作出初步的診斷，但確診要靠病原別離鑒定。六、豬鏈球菌病診斷技術1 引用標準參考GB/T 199 15.2-2005和GB/T 199 15.9-20052 范

16、圍適用于豬鏈球菌病診斷。3 材料3.1 綿羊血瓊脂4 組織染色鏡檢對最急性和急性病例，無菌采取集病死豬的心、肝、脾、肺、腎和淋巴結等組織做觸片，姬姆薩染色，鏈球菌可見較純的單個或成雙的圓形或橢圓形球菌, 有少量形成短鏈和長鏈，如見鏈球菌那么說明病料中可能含有鏈球菌。5 病原別離鑒定無菌取心、肝、脾、肺、腎或淋巴結內部組織劃線接種普通瓊脂綿羊血平板，36±1培養24±2 h，如果菌落生長緩慢，可延長至48±2 h后觀察。如果是豬鏈球菌2型，培養24 h，在普通瓊脂綿羊血平板形成圓形、微凸、外表光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明的菌落，直徑0.3 mm1mm，大多數菌株呈溶

17、血，局部菌株產生溶血。將可疑菌落做革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗。本菌為革蘭氏陽性球菌，菌體直徑l固體培養物以雙球菌為多，少量呈3個5個排列的短鏈，液體培養物以鏈狀為主，無芽孢，能形成莢膜。本菌過氧化氫酶試驗均為陰性。菌落生長特征、革蘭氏染色、菌體形態和過氧化氫試驗符合者，可初步確定為鏈球菌。6 生化鑒定 經初步鑒定后，做5乳糖、海藻糖、七葉苷、甘露醇、山梨醇、馬尿酸鈉等糖發酵試驗。7 PCR鑒定是否為豬鏈球菌2型 必要時進展豬鏈球菌2型毒力因子PCR檢測。7.1 儀器：臺式高速12000 r/min離心機；DNA擴增儀；水浴鍋；穩壓穩流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相分析系統；可調移液器一套，包

18、括120 L 2支，20200L 1支，2001000L 1支；與移液器匹配的滴頭；1.5 mL離心管；0.5 mL或0.2 mL與擴增儀配套塑料管。7.2 試劑7.2.1 細菌DNA提取試劑盒7.2.2 2.5 mmol/L dNTP7.2.3 10×PCR Buffer7.2.4 25 mmol/L MgCl27.2.5 10 pmol/L引物7.2.6 Taq DNA聚合酶7.2.7 50×TAE保存液和1×TAE使用液7.2.8 瓊脂糖：電泳級7.2.9 CYBgreen7.3 PCR引物根據豬鏈球菌2型溶血素基因設計引物，引物序列如下，其目的片斷長度為4

19、95 bp。sly1：5-CCCAAGTTCAAGCCGCATTTA-3(1542)sly2：5-GAAGATTGCGAGCATTTCCTG-3(2036)7.4 DNA提取 利用對數生長期的液體培養物，嚴格按照DNA提取試劑盒說明書進展。7.5 PCR擴增反響體系25L：細菌總DNA 5.0L10 pmol/L的上游引物 1.0L10 pmol/L的下游引物 1.0L2.5 mmol/L dNTPs混合物 2.0L10×PCR Buffer 2.5L25 mmol/L的MgCl2 2.0L5 U的TaqDNA聚合酶 0.3L雙蒸水補至25L。循環參數：95 預變性 5 min；94

20、 變性 1 min；56 退火 1 min； 共35個循環，72 延伸 1 min； 72 延伸10 min，4 保存。7.6 電泳檢測取1.5g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，制膠。在電泳槽中參加電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。取810l PCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液和CYBgreen混合后加樣，進展電泳。電壓大小根據電泳槽長度來確定，一般控制在3 V/cm5V/cm，電泳時間為30 min35 min。將電泳好的凝膠放紫外透射儀或凝膠成像系統上觀察結果。陽性對照的PCR產物電泳后在495 bp的位置上出現一條特異性條帶，陰性對照PCR產物電泳后沒有條帶，試驗結果成立

21、。在試驗結果成立的前提下，如果樣品中PCR產物電泳后在495 bp的位置上出現一條特異性條帶，判為該菌株含有豬鏈球菌2型溶血素基因。七、副豬嗜血桿菌HpsPCR診斷技術1 引用標準自定標準。2 范圍副豬嗜血桿菌診斷。3材料3.1 儀器：臺式高速12000 r/min離心機；DNA擴增儀；水浴鍋；穩壓穩流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相分析系統；可調移液器一套，包括120 L 2支，20200L 1支，2001000L 1支；與移液器匹配的滴頭；1.5 mL離心管；0.5 mL或0.2 mL與擴增儀配套塑料管。3.2 試劑 TSA培養基 TSB培養基3.2.3 10 mmol/L Tris/1

22、mmol/L EDTA溶液中 溶菌buffer (0.0005%Tween20，0.24 mg/mL proteinaseK和0.1 mol/L Tris，pH8.5)3.2.5 2.5 mmol/L dNTP3.2.6 10×PCR Buffer3.2.7 25 mmol/L MgCl23.2.8 10 pmol/L引物3.2.9 50×TAE保存液和1×TAE使用液 Loading Buffer 瓊脂糖 CYBgreen4 操作方法4.1 鏡檢對從臨床病癥疑似副豬嗜血桿菌病的發病仔豬的肺和脾作組織觸片，革蘭氏染色，副豬嗜血桿菌鏡檢呈革蘭氏陰性小球桿菌。4.2

23、別離培養取出患病仔豬病變肺、氣管分泌物、胸水、腹水及脾組織，劃線接種于TSA平板。37 ，5%CO2培養2448。副豬嗜血桿菌呈無色、透明、濕潤、光滑的露珠樣細小菌落，革蘭氏染色呈陰性小球桿菌，老齡培養物呈多形態(細小桿狀、短鏈狀和長絲狀)。4. 3 PCR引物設計 HP 16S1：5-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3 HP 16S2：5-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3該引物擴增出編碼16SrRNA的DNA局部片段，長度為822 bp。 tbpA55：5-TTAGCCTTGCTCTTCTTAGCC-3 tbpA33：5-AAGCTTGAAACTAAGGTACTCTAA-3

24、 該引物擴增出編碼轉鐵結合蛋白A的DNA局部片段，長度為1.9 kb。4.4 細菌DNA提取將TSA平板上典型菌落接種TSB，37 過夜培養，取對數生長期別離菌懸浮于10 mmol/L Tris/ 1 mmol/L EDTA溶液中，10000 r/min離心5min；棄上清，沉淀用溶菌buffer重懸；56 作用30 min；最后煮沸15 min；12000 r/min離心5min；收集上清，-20 保存備用。注：DNA的提取可以用試劑盒，按試劑盒操作說明進展，以節省時間，減少DNA損失。4.5 編碼16S rRNA的DNA局部片段的擴增反響體系25L：細菌總DNA 2.0L10 pmol/L

25、的上游引物 1.0L10 pmol/L的下游引物 1.0L2.5 mmol/L dNTPs混合物 2.0L無Mg2+緩沖液 2.5L25 mmol/L的MgCl2 1.5L5 U的TaqDNA聚合酶 0.3L雙蒸水補至25L。循環參數：95 預變性 5 min；94 變性 30 s；59退火 30 s； 共30個循環，72 延伸 90 s；72 延伸 10 min。4.6 編碼tbpA的DNA局部片段的擴增反響體系同4.5，循環參數為：94 預變性 5 min;94 變性 1 min； 50 退火 1 min； 共30個循環72延伸 2 min；最后72 延伸 10 min。4.7 結果分析與

26、判定4.7.1 1瓊脂糖凝膠板的制備稱取1 g瓊脂糖，參加100 mL 1×TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。依據樣品數選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子膠中形成加樣空，放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。 加樣取68 L PCR擴增產物和23 L加樣緩沖液和適量CYBgreen混勻后參加一個加樣孔。每次電泳至少加1孔陽性對照的擴增產物作為對照，沒有陽性對照的情況下，一定加Marker。 電泳電壓80100 V，或電流4050 mA，電泳3040 min。 結果觀察與判定電泳完畢后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，翻開紫外燈觀

27、察。如某一待檢樣品擴增產物的DNA帶與陽性對照的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離一樣，或根據Marker判定大小與設計的大小820 bp和1.9 kb一致，那么該樣品判定為陽性。5 診斷判定同份樣品在2個PCR中全部陽性的才可以判為本豬群已經感染Hps，根據流行病學、臨床病癥和病理變化判定豬群是否發病。八、豬繁殖與呼吸綜合征PRRSPCR檢測技術1 引用標準自定標準。2 范圍 適用于PRRS的PCR診斷。3材料3.1 儀器：組織勻漿機；低溫臺式高速12000 r/min離心機；DNA擴增儀；水浴鍋；穩壓穩流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相分析系統；可調移液器一套，包括120 L 2支，20

28、200L 1支，2001000L 1支；與移液器匹配的滴頭；1.5 mL離心管；0.5 mL或0.2 mL與擴增儀配套塑料管。3.2 試劑 Trizol試劑 氯仿異丙醇 反轉錄酶M-MLV200 U/µL3.3.5 75%乙醇3.2.6 0.1%焦碳酸二乙酯DEPC水溶液3.2.7 2.5 mmol/L dNTP3.2.8 10×PCR Buffer3.2.9 25 mmol/L MgCl23.2.10 10 pmol/L引物3.2.11 50×TAE保存液和1×TAE使用液 Loading Buffer 瓊脂糖 Oligo(dT)1850 mol/L

29、CYBgreen4 操作步驟4.1 樣品采集取疑似豬的肺臟、淋巴結和脾臟病變部位組織，-20 保存備用。4.2 樣品處理取局部組織樣品，磨碎并用0.01M PBSPH 7.27.4稀釋成1: 5乳劑或將病料用剪刀剪成小塊，放入5 mL青霉素小瓶，進一步剪碎，按5倍體積的0.01M PBS后，用勻漿機勻漿，-20保存備用或立即用于RNA提取。4.3 RNA的提取a) 取處理好的稀釋樣品200300 µL，參加700 µL TRIZOL試劑，渦懸混勻，在1530 溫育23 min；參加200 µL的氯仿，蓋緊管蓋，上下顛倒混勻15 s，1530溫育23 min，28

30、12000 g離心15 min；b) 轉移水相500 µL到一新的離心管中，參加0.5 mL的異丙醇，1530作用10 min，28 12000 g離心10 min；c) 棄去上清液，參加75%乙醇1.0 mL，振搖，28 7500 g離心5 min；d) 棄去上清，枯燥沉淀物室溫約5 min；參加20 µL DEPC水溶解，-20 保存或立即使用置冰上。4.4 引物設計根據文獻和PRRSV代表株VR2332和LV設計了一對引物：PRRSV N1： 5-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3PRRSV N2： 5-TCGCCCTAATTGAATAGGTG-34.5 RT

31、總體積為10 µL，反響體系如下：5×RT buffer 2.0 µLdNTP10 mmol/L 0.25 µLOligo(dT)18 0.5 µLRNA 模板 7 µL混勻離心，65 作用10 min，冰上冷卻，參加M-MLV 200 U/µL 0.25 µL，421h，冰上冷卻后作為PCR模板。4.6 PCRPCR 反響總體積為25 µL，包括：2條PRRSV引物10 pmol/µL 各1 µLMg+(25 mmol/L) 1.5 µLdNTP (2.5 mmol/L)

32、2.0 µL10×Buffer 2.5 µLTaq 酶5 U/µL 0.2 µL模板cDNA 5 µL滅菌雙蒸水 11.8 µL瞬時離心混勻，將PCR反響管置于PCR儀內。PCR反響參數為：95預變性 5 min；94 45 min；51 45 min； 共35個循環，72 1 min；72延伸 10 min。將PCR產物放4 保存或立即做瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產物。4.7 結果分析與判定4.7.1 1.5瓊脂糖凝膠板的制備稱取1.5 g瓊脂糖，參加100 mL 1×TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的

33、凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。依據樣品數選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子膠中形成加樣空，放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。 加樣取68 L PCR擴增產物和23 L加樣緩沖液和和適量CYBgreen混勻后參加一個加樣孔。每次電泳至少加1孔陽性對照的擴增產物作為對照，沒有陽性對照的情況下，一定加Marker。 電泳電壓80100 V，或電流4050 mA，電泳3040 min。 結果觀察與判定電泳完畢后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，翻開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴增產物的DNA帶與陽性對照的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離一樣，或根據Marker判定大小與設計的大小

34、400 bp或430 kb一致，那么該樣品判定為陽性。5 診斷判定PCR檢測結果陽性，說明該豬群已感染PRRSV，根據流行病學、臨床病癥和病理變化判定豬群是否發病。九、古典豬瘟CSFVPCR檢測技術1 引用標準自定標準。2 范圍適用于古典豬瘟CSFV的PCR診斷。3材料3.1 儀器：組織勻漿機；低溫臺式高速1300020000 r/min離心機；DNA擴增儀；水浴鍋；穩壓穩流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相分析系統；可調移液器一套，包括120 L 2支，20200L 1支，2001000L 1支；與移液器匹配的滴頭；1.5 mL離心管；0.5 mL或0.2 mL與擴增儀配套塑料管。3.2 試劑

35、 Trizol試劑 氯仿 異丙醇 反轉錄酶M-MLV200 U/µL3.3.5 75%乙醇3.2.6 0.1%焦碳酸二乙酯DEPC水溶液3.2.7 2.5 mmol/L dNTP3.2.8 10×PCR Buffer3.2.9 25 mmol/L MgCl23.2.10 10 mol/L引物3.2.11 50×TAE保存液和1×TAE使用液 Loading Buffer 瓊脂糖 BSA(0.4 mg/mL) CYBgreen4 操作方法4.1 病料采集：可用于檢測的病料包括扁桃體、淋巴結、脾臟和母豬流產胎兒及死胎(扁桃體、淋巴結和脾臟)，-20 保存備用

36、。4.2 病料處理：取局部材料0.52.0 g于無菌研缽，磨碎并用PBS0.01M, PH 7.27.4稀釋成1: 5乳劑或將病料用剪刀剪成小塊，放入5 mL青霉素小瓶，進一步剪碎，按5倍體積的PBS后，用勻漿機勻漿，-20 保存備用或立即用于RNA提取。4.3 RNA提取a) 取處理好的稀釋樣品200300 µL，參加700 µL TRIZOL試劑，渦懸混勻，在1530 溫育23 min；參加200 µL的氯仿，蓋緊管蓋，上下顛倒混勻15 s，1530溫育23 min，28 12000 g離心15 min；b) 轉移水相500 µL到一新的離心管中，參

37、加0.5 mL的異丙醇，1530作用10 min，28 12000 g離心10 min；c) 棄去上清液，參加75%乙醇1.0 mL，振搖，28 7500 g離心5 min；d) 棄去上清，枯燥沉淀物室溫約5 min；參加20 µL DEPC水溶解，-20 保存或立即使用置冰上。4.4 引物設計根據華中農業大學2004年在Genbank中公開發表的序列DQ127910設計的引物，產物大小為374bp，引物序列如下：gE1: 5'-CCACCCGACGCTACGATTGT-3'gE2: 5'-CTGGCATCCATCATTCCCTG-3'4.5 RT以提

38、取到的組織總RNA為模板，進展反轉錄，反轉錄體系為20µL。反轉錄體系如下：RNA 7 µL10 mol/L引物(gE1/gE2) 1 µL于70水浴中5分鐘，然后室溫冷卻10分鐘；再參加： dNTP (10 mM) 1 µL5×M-MLV buffer 4 µLBSA(0.4 mg/mL) 5 µLM-MLV 反轉錄酶 1 µL 混均后，37水浴45-60分鐘。-20保存。4.6 PCR擴增反響cDNA 5.0 µL10×PCR buffer 2.5 µLdNTP (2.5 mM)

39、2.0 µLMgCl225 mM 1.5 µL上游引物10 mol/L 1.0 µL下游引物10 mol/L 1.0 µLTaq DNA聚合酶5 U 0.2 µL滅菌雙蒸水 1.8 µL配好反響液后，將PCR反響管置于PCR儀內，循環參數如下：95 5 min94 45 min;56 45 min; 共35個循環72 1 min；72 10 min將PCR產物放4 保存或立即做瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產物。4.7 結果分析與判定4.7.1 1.5瓊脂糖凝膠板的制備稱取1.5 g瓊脂糖，參加100 mL 1×TAE中，加熱融

40、化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。依據樣品數選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子膠中形成加樣空，放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。 加樣取68 L PCR擴增產物和23 L加樣緩沖液和適量CYBgreen混勻后參加一個加樣孔。每次電泳至少加1孔陽性對照的擴增產物作為對照，沒有陽性對照的情況下，一定加Marker。 電泳電壓80100 V，或電流4050 mA，電泳3040 min。 結果觀察與判定電泳完畢后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，翻開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴增產物的DNA帶與陽性對照的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離一樣，或根據Mar

41、ker判定大小與設計的大小370 bp一致，那么該樣品判定為陽性。5 診斷判定如果是在免疫后20 d采集的樣品，PCR檢測結果陽性，說明該豬群已感染野毒，根據流行病學、臨床病癥和病理變化判定豬群是否發病。十、豬細小病毒(PPV)PCR診斷技術1 引用標準自定標準。2 范圍 適用于豬細小病毒PPV病的PCR診斷。3材料3.1 儀器：臺式高速離心機；DNA擴增儀；水浴鍋；穩壓穩流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相分析系統；可調移液器一套，包括120 L 2支，20200L 1支，2001000L 1支；與移液器匹配的滴頭；1.5 mL離心管；0.5 mL或0.2 mL與擴增儀配套塑料管。3.2 主要

42、試劑 TEN緩沖液3.2.2 10SDS3.2.3 20 mg/mL 蛋白酶K 飽和酚 酚：氯仿：異戍醇25:24:1 氯仿：異戍醇24：1 純乙醇3.2.8 2.5 mmol/L dNTP3.2.9 10×PCR Buffer3.2.10 25 mmol/L MgCl23.2.11 10 mol/L引物3.2.12 50×TAE保存液和1×TAE使用液 Loading Buffer 瓊脂糖 CYBgreen4 操作步驟：4.1 樣品的采集：采集病豬的淋巴結、脾臟、肝臟置-20 保存。4.2 樣品處理和DNA提取a) 所采病料經組織研磨器充分研磨，按1: 5用TE

43、N緩沖液懸浮收集于離心管內，-70 反復凍融3次，7000 r/min離心5 min。b) 取上清液472.5 l,參加25 l 10SDS和2.5 l的20 mg/mL 蛋白酶K，50 水浴搖床上放置2 h。c) 參加等量的飽和酚500 l，渦旋20 s。d) 離心取上清液，加等量的酚：氯仿：異戍醇25:24:1抽提一次。e) 用氯仿：異戍醇24:1再抽提一次。f) 用乙醇沉淀，真空抽干后參加20 l雙蒸水溶解，-20貯存備用。4.3 引物根據GenBank中公開發表的序列，設計擴增豬細小病毒VP2基因局部片段，序列如下：P1: 5-CAGAATCAGCAACCTCAC-3P2: 5-TGG

44、TCTCCTTCTGTGGTAGG-34.4 PCR 反響體系25l，組成如下： 引物 各1.0l 25mM MgCl2 1.5 l dNTPs 2.0 l10×緩沖液 2.5 l Taq聚合酶 0.2 l DNA模板 3.0 l 滅菌去離子水 13.8 l 擴増條件為：94 變性3 min，進入循環，94 45 s，54 45 s，72 60 s，30個循環后，72 延伸10 min。4.5 結果分析與判定4.5.1 1.5瓊脂糖凝膠板的制備稱取1.5 g瓊脂糖，參加100 mL 1×TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。依據樣品數選用

45、適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子膠中形成加樣空，放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。 加樣取68 L PCR擴增產物和23 L加樣緩沖液和和適量CYBgreen混勻后參加一個加樣孔。每次電泳至少加1孔陽性對照的擴增產物作為對照，沒有陽性對照的情況下，一定加Marker。 電泳電壓80100 V，或電流4050 mA，電泳3040 min。 結果觀察與判定電泳完畢后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，翻開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴增產物的DNA帶與陽性對照的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離一樣，或根據Marker判定大小與設計的大小440 bp一致，那么該樣品判定為陽性。十一

46、、口蹄疫(FMDV)PCR診斷技術1 引用標準參考GB/T18935-2003和OIE FMDV參考實驗室的方法NB: VERSION ADOPTED MAY 2006。2 范圍 適用于FMDV O型和Asia I型的PCR診斷。3 樣品采集3.1 水泡液和水泡皮：用一次性注射器抽取水泡液，用灼燒的止血鉗封死注射器前端，放入保鮮盒，加冰貯存送檢；將水泡皮剪下，放入干凈青霉素瓶中，放入保鮮盒加凍貯存送檢。3.2 組織臟器：如血液、淋巴結、肌肉等。取樣后放入干凈青霉素瓶或干凈食袋中，于保鮮盒內加冰貯存送檢。3.3 鼻咽拭子：用滅菌的棉簽采集后，放保鮮袋中加冰貯存送檢。4 樣品處理 4.1 水泡皮、

47、臟器等：取1-2 g用無菌PBS緩沖液0.04 M, pH7.2-7.4沖洗干凈，剪碎、研磨，用PBS稀釋成1:21:5的懸液置4 冰箱過夜。8000 rpm離心5 min，取上清液為檢測材料。4.2 鼻咽拭子：參加2 mL PBS緩沖液，充分擠壓，取出棉簽8000 rpm離心5 min，取上清液。4.3 血液、水泡液：血液可直接作檢測材料；水泡液于8000 rpm離心5 min后取上清，假設量太少可適當參加PBS緩沖液。5 PCR診斷5.1 引物根據Genbank中AsiaI Jiangsu株自行設計引物，片段大小約330 bp，序列如下：Asia1: 5-ACTCACCCAGCCCAAGA

48、GCAC-3Asia2: 5-GCGTGCAAGGGCGGCGAGATC-3根據武漢大學在Genbank中公開發表的序列自行設計，擴增片段大小約350 bp，序列如下：O1: 5-GTCAAGCCACAGGAACAGG-3O1: 5-AGAGTTCTTTCTGCCTTCTGAGC-35.2 RNA提取a) 取處理好的稀釋樣品200300 µL，參加700 µL TRIZOL試劑，渦懸15 s混勻，室溫靜止3 min；參加200 µL的氯仿，蓋緊管蓋，上下顛倒混勻15 s，室溫靜止3 min，28 20000 g離心15 min；b) 轉移水相500µL到一新的離心管中，參加0.5 mL的異丙醇，混勻，室溫靜止10 min，28 20000 g離心10 min；c) 棄去上清液，參加70%乙醇1.0 mL，振搖，28 20000 g離心10 min；d) 棄去上清，枯燥沉淀物室溫約5 min；參加20 µL DEPC水溶解，-20 保存或立即使用置冰上。5.