1、探討大豆苷元對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的抑制作用    摘要：目的探討大豆苷元對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤 細(xì)胞凋亡和增殖的影響。方法采用細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)（法）、流式細(xì)胞儀檢測(cè)等方法觀察 細(xì)胞的形態(tài)變化、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期變化。結(jié)果 的大豆苷元明顯抑制細(xì)胞的增殖，且有劑量依賴(lài)性；與對(duì)照組相比，大豆苷元處理 后，各組 細(xì)胞均出現(xiàn)亞二倍體峰（ ），細(xì)胞凋亡率與大豆苷元呈劑量依賴(lài)性。結(jié)論大豆苷元可誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤 細(xì)胞凋亡，對(duì) 細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。 關(guān)鍵詞：  神經(jīng)母細(xì)胞瘤 大豆苷元 增殖    神經(jīng)母細(xì)胞瘤（， ）是兒童較常見(jiàn)的

2、惡性腫瘤，發(fā)病率占兒童惡性腫瘤的第 位，與兒童期常見(jiàn)的其他惡性腫瘤相比，化療效果差，嚴(yán)重威脅兒童的生命安全。因此，尋找新的治療藥物成為人們十分關(guān)切的問(wèn)題。近年來(lái)，多種研究發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮對(duì)多種癌癥具有抑制和治療作用 ，但對(duì)大豆異黃酮抗癌作用的研究主要集中在乳腺癌和前列腺癌等激素依賴(lài)性腫瘤，關(guān)于其對(duì)兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)作用的影響研究報(bào)道很少。因此，我們于體外觀察了大豆苷元對(duì) 細(xì)胞株 生長(zhǎng)的影響，以期為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。  材料與方法  材料 細(xì)胞株為貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。大豆苷元（）為陜西賽德高科生物股份有限公司饋贈(zèng)，純度為。 為 公司

3、生產(chǎn)，小牛血清為杭州四季青公司生產(chǎn)，二甲基啞砜（）和噻唑藍(lán)（）為 公司生產(chǎn)。 流式細(xì)胞儀為美國(guó) 公司生產(chǎn)； 型酶標(biāo)儀和 型 培養(yǎng)箱均為美國(guó) 公司生產(chǎn)。   方法  細(xì)胞培養(yǎng)與接種 細(xì)胞株培養(yǎng)在含小牛血清的 培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)箱內(nèi)（），恒溫。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)，用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞， ，離心 ， 洗 次，以 × 的濃度接種于 孔板內(nèi)，每孔體積為 。  受試藥物的處理將大豆苷元溶解在 中，配成 的儲(chǔ)存液， 保存。使用時(shí)用完全培養(yǎng)基將其稀釋成 的工作液，用直徑為 的微孔濾膜過(guò)濾除菌置于保存，并進(jìn)一步用完全培養(yǎng)基分別稀釋成所需的不同濃度，待細(xì)胞接種 后分別

4、加入不同濃度的受試藥，每孔 ，使其終濃度分別為， ， ， ， 。每個(gè)濃度為 個(gè)孔，同時(shí)用含 的完全培養(yǎng)基和空白一起作對(duì)照。 用（ ）配成 的溶液，磁力攪拌器攪拌 ，直徑為 的微孔濾膜過(guò)濾除菌后保存， 周內(nèi)有效。  細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)的測(cè)定采用 比色法 。細(xì)胞接種 后加受試藥，之后每隔 用 比色法測(cè)定光密度值，即對(duì)應(yīng)的活細(xì)胞數(shù)。具體操作如下：加受試藥后每隔一定時(shí)間加 溶液 ，繼續(xù)培養(yǎng) ，終止培養(yǎng)后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入 ，振蕩器振蕩 ，使結(jié)晶物充分溶解。選擇 波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)各孔的光吸收值，記錄大豆苷元作用于 細(xì)胞的濃度效應(yīng)數(shù)據(jù)和時(shí)間效應(yīng)數(shù)據(jù)，用下列公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生

5、長(zhǎng)的抑制率，并繪制效應(yīng)曲線。    抑制率（）對(duì)照孔測(cè)定的平均OD 值加藥組測(cè)定的平均OD 值照孔測(cè)定的平均OD 值×%表1  大豆苷元對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖抑制率的影響（略）與對(duì)照組比較，P0.05；n=3  流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分析各組細(xì)胞培養(yǎng) 后，收集各組細(xì)胞懸液 ，濃度約為 個(gè)， 離心 ，棄掉培養(yǎng)液，用 離心沖洗兩次，以的冷乙醇固定，保存 ，  離心 后， 洗滌沖洗去乙醇 次；加入 （終濃度為 ），搖勻，溫育 ；加入（終濃度為）染料 ，暗染。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每份標(biāo)本測(cè)定（ ） × 個(gè)細(xì)胞，采用

6、 軟件對(duì)各組樣本進(jìn)行 含量及細(xì)胞周期分析。  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 次以上。所有的測(cè)定指標(biāo)均采用±s表示，用 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，凋亡實(shí)驗(yàn)用方差分析，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用t檢驗(yàn)。以P 表示差異有顯著性。  結(jié)果  大豆苷元對(duì) 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，大豆苷元各濃度組處理 的細(xì)胞抑制率與正常對(duì)照組比較均有顯著性升高（P）（表，圖）。大豆苷元處理 細(xì)胞， 的 分別是， 。以上結(jié)果表明大豆苷元對(duì) 細(xì)胞的體外增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，其抑制作用在一定的范圍內(nèi)有劑量和時(shí)間依賴(lài)性，并呈現(xiàn)出一定的飽和性。圖1  大豆苷元對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞體外增殖的抑制作用（略）  大豆苷元對(duì) 細(xì)胞周期和凋亡的影響藥物處理 后，大豆苷元各濃度組均能誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡， 峰前出現(xiàn)亞二倍體峰（ ），即凋亡細(xì)胞所特有的凋亡峰（圖）。大豆苷元誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，細(xì)胞凋亡率顯著高于正常對(duì)照組（P ）。隨著大豆苷元濃度的升高， 和 期的細(xì)胞明顯減少， 合成期（期）細(xì)胞數(shù)均明顯增多，表明大豆苷元使 細(xì)胞發(fā)生期阻滯，抑制細(xì)胞增殖。圖2   大豆苷元對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞周期和凋亡的影響（略