1、構建具有神經支配的工程化心肌組織的初步研究 11-02-08 17:03:00 編輯：studa20 作者：王靜，郭立國，馮金升，任紅茹【摘要】【關鍵詞】 組織工程；心肌細胞；PC12細胞；共培養；神經支配；神經生長因子 Abstract：To investigate the possibility of neuronal PC12 cells being used as models to investigate the innervation of tissue-engineered cardiac tissue.Neonatal rat primary cardiacmyocytes i

2、solated with using 0.25% trypsin containing 0.04%EDTA were cocultured with the NGF induced sympathetic neuron-like PC12 cells in liquid type I collagen liquid . After that , H.E. staining , immunhistochemistry staining and transmission electron microscopy were used to evaluate it. Result showed that

3、 in the 3-D co-culture model, NGF induced PC12 cells outgrew processes which reached the surface of the cardiacmyocytes and moved along with the beat of cardiomyocytes. Their varicosities also touched with cariamyocytes.The results of our study suggest that PC12 cells is a feasible model to be used

4、in the study of neural innervation of tissue engineered cardiac tissue. And the cardiomyocytes may be innervated in this model. Key words：Tissue engineering； Cardiomyocytes； PC12;；Co-culture；Innervation； Nerve growth factor 1 引 言 神經系統對機體各組織、器官及系統的發生、發育過程具有重要作用。神經系統使機體各部分在功能上成為整體。近年來，組織工程研究發展迅速，國內外研究

5、人員相繼成功地體外復制了軟骨1、骨2、皮膚3以及心肌4等組織。但是，要保證組織工程化產品在體內移植后的存活，充分的血液供應和完善的神經支配起著決定性因素。如何在構建工程化組織的同時重建其血液供應和神經支配，已成為組織工程研究從基礎研究向臨床應用過渡的關鍵性問題。到目前為止，工程化心肌組織的血管化5研究進展順利，而其神經支配研究由于神經系統的復雜性及缺乏合適的體外模型，目前尚未見報道。 心肌和其他肌肉組織一樣，神經的有效支配在其發揮正常生理功能方面起著重要作用。Dianne6等（1991年）將胸腰部交感神經節和心肌細胞共培養，發現具有腎上腺素能支配的心肌細胞的體積明顯增大，表明神經支配有利于心肌

6、細胞的生長。李振中7等（1996年）將大鼠脊神經節與心肌細胞聯合培養，發現神經纖維終止于搏動的心肌細胞表面。上述通過二維條件下，心肌細胞與神經細胞共培養的結果表明，神經細胞與心肌細胞共培養能夠相互影響，并有利于心肌細胞的生長發育和功能的發揮。 由于原代分離培養的交感神經元對體外生存環境要求較高，而NGF誘導后的交感神經元樣PC12細胞培養條件更為簡單，培養過程中狀態也相對穩定。工程化心肌組織的培養環境主要涉及到心肌組織的生長與存活，因此很難同時滿足原代分離神經元的生長要求?；诖耍狙芯窟x用NGF誘導分化的PC12細胞與心肌細胞在液態膠原中共培養作為模型，對構建具有神經支配的工程化心肌組織進行

7、了初步的探索性研究，以探討體外再造具有神經支配的心肌組織工程的可行性，并為心肌組織工程的神經支配研究提供初步的資料。 2 材料與方法 2.1 材料 22 方法 11-02-08 17:03:00 編輯：studa20 3結 果 3.1 相差顯微鏡下觀察的結果 相差顯微鏡下觀察，第二天即可見單個的神經細胞長出突起，隨著時間的延長，長出突起的細胞越來越多，突起也越來越長，在心肌細胞的表面延伸（見圖1A）。心肌細胞在培養的第二天即可見單個細胞在跳動，第三天即可見一簇一簇的細胞在跳動，第五天神經細胞生長的神經突起呈放射狀到達心肌細胞的表面并隨心肌細胞一起跳動（見圖1B）。圖1 PC12與心肌細胞在液態

8、膠原中混合培養的相差顯微 鏡下觀察的結果 A.神經細胞長出的神經突起（）分別到達心肌細胞 （）的表面(40) B.神經細胞長出的神經突起（）呈放射狀到達心肌 細胞的表面并隨心肌細胞一起跳動(40) Fig 1 Phase contrast microscope result of innervated tissue-engineered cardiac sheet(40) 3.2 HE染色結果 由于本實驗采用低密度的PC12細胞植入，因此PC12細胞分散在原代心肌細胞的網絡中。PC12細胞的核較大，而心肌細胞的核較小，核均為藍色（見圖2）。 3.3 免疫組化染色結果 采用a-肌小節肌動蛋白免疫

9、組化染色對心肌細胞進行鑒定，胞漿呈棕色(見圖3A)。采用NF對神經纖維進行免疫組化染色（見圖3B），可觀察到NF陽性的細胞胞核較大，其周圍有一些染色陰性的心肌細胞，胞核較小。 3.4 透射電鏡觀察結果 PC12細胞與新生大鼠心肌細胞在液態膠原中混合培養后，圖中可見心肌細胞、心肌纖維和神經突起。N1、N2 為神經纖維，C為心肌細胞（見圖4）。M為心肌纖維（見圖5），S為PC12與心肌細胞之間的突觸（見圖6）。4 討 論 本研究以NGF誘導后的交感神經元樣PC12細胞與新生大鼠心肌細胞共培養和體外構建組織工程化心肌片層的研究為基礎，以NGF誘導后的交感神經元樣PC12細胞與新生大鼠新室肌細胞為種子

10、細胞，以膠原、Matrigel為支架材料，進行構建具有神經支配的工程化心肌片層的初步探索性研究。通過組織學、免疫組化的檢測與透射電鏡的觀察，發現PC12細胞在三維條件下，經NGF誘導產生較長的神經突起；PC12細胞與心肌細胞在三維條件下共培養，神經細胞生長的神經突起呈放射狀到達心肌細胞的表面與心肌細胞一起跳動，且長出的神經突起能與原代心肌細胞形成形態上非常疑似突觸連接的結構。 由于各組織與器官中神經系統的復雜性，到目前為止，組織工程化產品的神經支配研究進展相對比較緩慢，僅在骨組織工程的神經支配研究中取得部分進展，張元平等10（2005）將感覺神經、運動神經分別植入組織工程骨修復兔股骨缺損，與單

11、純組織工程骨和組織工程骨中植入血管束的修復效果相比較，發現利用感覺神經束植入的方法可以提高組織工程骨的成骨作用,而植入運動神經束卻無此作用。這項研究為組織工程骨的神經化重建奠定了一定的基礎。而其它組織工程化產品的神經支配研究則未見報道。 近年來組織工程研究領域發展迅速，心肌組織工程研究也取得了很大的進展，國內外有關心肌組織構建物的報道日益增多，德國科學家Zimmermann 等人11（2002年）成功在體外構建了組織工程心肌條帶，軍事醫學科學院趙云山博士等12（2004年）在Zimmermann研究基礎上，構建出類似天然心肌的心肌條帶，并對細胞接種濃度及膠原凝膠含量與再造條件的關系進行了深入研

12、究。上述體外培養的可供移植的環狀條帶給治療心臟疾患帶來了新的希望。但是，要保證工程化心肌組織在體內移植后的存活，充分的血液供應和完善的神經支配起著決定性因素。 隨著心肌組織工程研究深入，以及向臨床過渡的逐漸展開，一個主要的問題就是如何使構建的工程化心肌組織在體內存活并迅速發揮作用。帶有血管系統和神經支配的復合工程化心肌組織符合仿生學觀點，是理想的解決方案。關于心肌組織血液供應的形式已有較廣泛的研究，比如, 國內外一些實驗室應用混合細胞構建工程化組織的技術方法，觀察不同細胞間的相互作用對血管形成的影響, 嘗試進行工程組織體外人工血管化，使移植后的組織盡快與宿主之間建立血液循環。Zimmerman

13、n等13（2003）發現，在缺血模型中，利用混有其它細胞的心肌細胞構建的工程化心肌組織的心肌收縮力比單純由心肌細胞構建的強兩倍。不僅如此，Zimmermann等14（2002）還觀察到，混合細胞構建的工程化心肌組織，同時出現了初級毛細血管和大血管樣結構。這些血管樣結構在移植后較快與宿主建立了血液循環。 在心肌組織的神經支配方面，由于心肌的神經支配比較復雜，且沒有合適的體外研究模型。因此，一方面要對心臟神經的解剖學、形態學、生理學做進一步的研究，另一方面應對心肌組織工程神經支配的方式進行必要的探索，以便加快心肌組織工程向臨床的應用。雖然近年來心肌組織工程血管化研究發展迅速，但是，到目前為止，心肌

14、組織工程的神經支配研究尚未見報道。本研究是在以往研究的基礎上，首次對工程化心肌組織的神經支配進行探索性研究?！緟⒖嘉墨I】 1Masuda K,HejnaMJ, HejnaMJ.A novel two-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by muture bovine chondrocytes:the alginate-recovered-chondrocyte(ARC)methodJ. Journal of Orthopaedic Research,2003,21:139-148.2Devin JE,Lau

15、rencin CT, Laurencin CT .Three-dimensional deg 11-02-08 17:03:00 編輯：studa20 3結 果 3.1 相差顯微鏡下觀察的結果 相差顯微鏡下觀察，第二天即可見單個的神經細胞長出突起，隨著時間的延長，長出突起的細胞越來越多，突起也越來越長，在心肌細胞的表面延伸（見圖1A）。心肌細胞在培養的第二天即可見單個細胞在跳動，第三天即可見一簇一簇的細胞在跳動，第五天神經細胞生長的神經突起呈放射狀到達心肌細胞的表面并隨心肌細胞一起跳動（見圖1B）。圖1 PC12與心肌細胞在液態膠原中混合培養的相差顯微 鏡下觀察的結果 A.神經細胞長出的神經突

16、起（）分別到達心肌細胞 （）的表面(40) B.神經細胞長出的神經突起（）呈放射狀到達心肌 細胞的表面并隨心肌細胞一起跳動(40) Fig 1 Phase contrast microscope result of innervated tissue-engineered cardiac sheet(40) 3.2 HE染色結果 由于本實驗采用低密度的PC12細胞植入，因此PC12細胞分散在原代心肌細胞的網絡中。PC12細胞的核較大，而心肌細胞的核較小，核均為藍色（見圖2）。 3.3 免疫組化染色結果 采用a-肌小節肌動蛋白免疫組化染色對心肌細胞進行鑒定，胞漿呈棕色(見圖3A)。采用NF對神經

17、纖維進行免疫組化染色（見圖3B），可觀察到NF陽性的細胞胞核較大，其周圍有一些染色陰性的心肌細胞，胞核較小。 3.4 透射電鏡觀察結果 PC12細胞與新生大鼠心肌細胞在液態膠原中混合培養后，圖中可見心肌細胞、心肌纖維和神經突起。N1、N2 為神經纖維，C為心肌細胞（見圖4）。M為心肌纖維（見圖5），S為PC12與心肌細胞之間的突觸（見圖6）。4 討 論 本研究以NGF誘導后的交感神經元樣PC12細胞與新生大鼠心肌細胞共培養和體外構建組織工程化心肌片層的研究為基礎，以NGF誘導后的交感神經元樣PC12細胞與新生大鼠新室肌細胞為種子細胞，以膠原、Matrigel為支架材料，進行構建具有神經支配的工

18、程化心肌片層的初步探索性研究。通過組織學、免疫組化的檢測與透射電鏡的觀察，發現PC12細胞在三維條件下，經NGF誘導產生較長的神經突起；PC12細胞與心肌細胞在三維條件下共培養，神經細胞生長的神經突起呈放射狀到達心肌細胞的表面與心肌細胞一起跳動，且長出的神經突起能與原代心肌細胞形成形態上非常疑似突觸連接的結構。 由于各組織與器官中神經系統的復雜性，到目前為止，組織工程化產品的神經支配研究進展相對比較緩慢，僅在骨組織工程的神經支配研究中取得部分進展，張元平等10（2005）將感覺神經、運動神經分別植入組織工程骨修復兔股骨缺損，與單純組織工程骨和組織工程骨中植入血管束的修復效果相比較，發現利用感覺

19、神經束植入的方法可以提高組織工程骨的成骨作用,而植入運動神經束卻無此作用。這項研究為組織工程骨的神經化重建奠定了一定的基礎。而其它組織工程化產品的神經支配研究則未見報道。 近年來組織工程研究領域發展迅速，心肌組織工程研究也取得了很大的進展，國內外有關心肌組織構建物的報道日益增多，德國科學家Zimmermann 等人11（2002年）成功在體外構建了組織工程心肌條帶，軍事醫學科學院趙云山博士等12（2004年）在Zimmermann研究基礎上，構建出類似天然心肌的心肌條帶，并對細胞接種濃度及膠原凝膠含量與再造條件的關系進行了深入研究。上述體外培養的可供移植的環狀條帶給治療心臟疾患帶來了新的希望。但是，要保證工程化心肌組織在體內移植后的存活，充分的血液供應和完善的神經支配起著決定性因素。 隨著心肌組織工程研究深入，以及向臨床過渡的逐漸展開，一個主要的問題就是如何使構建的工程化心肌組織在體內存活并迅速發揮作用。帶有血管系統和神經支配的復合工程化心肌組織符合仿生學觀點，是理想的解決方案。關于心肌組織血液供應的形式已有較廣泛的研究，比如, 國內外一些實驗室應用混合細胞構建工程化組織的技術方法，觀察不同細胞間的相互作用對血管形成的影響, 嘗試進行工程組織體外人工血管化，使移植后的組織盡快與宿主之間建