1、    體外培養(yǎng)破骨細胞功能的定量評定        摘要目的建立適用于體外藥理學研究的破骨細胞骨吸收功能的定量評定方法。方法機械分離法獲得破骨細胞，接種于象牙簿片底物上，分別于培養(yǎng)1d、3d、5d、7d取出象牙簿片各4張，采用光鏡和掃描電鏡觀察骨吸收陷窩數(shù)量的變化；對隨機拍攝的陷窩照片進行計算機形態(tài)計量分析，測算陷窩的面積和深度。結果骨吸收陷窩計數(shù)光鏡法和掃描電鏡法具有良好的相關性，r0.9998，P0.001。隨著培養(yǎng)時間的延長，陷窩數(shù)量逐漸增多、面積擴大、深度加深。結論

2、骨吸收陷窩計數(shù)光鏡法可以用于體外培養(yǎng)破骨細胞功能的定量評價，結合陷窩面積和深度分析，可以較為全面地評價體外培養(yǎng)破骨細胞的骨吸收功能。關鍵詞破骨細胞骨吸收陷窩數(shù)量面積深度 Quantitative Evaluation of The Function of Osteoclast Gultured in VitroZhan Hongshenget al Zhejiang college of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou (310053)Shi Yinyu,Zhao Yongfang(Shanghai University of TCM)Key wor

3、ds osteoclast,bone absorptive lacunae,amount,area,depth正常骨重建起始于破骨細胞的激活，破骨細胞性骨吸收伴隨生命活動的始末，破骨細胞異常活躍或功能低下，可誘發(fā)一系列臨床病癥，如骨質(zhì)疏松癥、Paget氏病、關節(jié)置換術后假體松動、牙周病變或骨硬化癥等。體外破骨細胞培養(yǎng)方法的建立，將有助于豐富對破骨細胞活化和功能調(diào)控機制的認識，而穩(wěn)定、靈敏的破骨細胞功能評價方法，對新藥的研制和開發(fā)是十分必要的。1材料與方法1.1主要試劑和儀器Medium 199培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)為Gibco公司產(chǎn)品，戊二醛、甲苯胺藍

4、為E.Merck公司產(chǎn)品，24孔培養(yǎng)板為Costar公司產(chǎn)品；Leitz 1600型鋸式切片機，SB 2200 型超聲波清洗儀，Nikon 102型光學顯微鏡，日立S-520型掃描電鏡，MTDS-B多功能顯微影像真彩色數(shù)字化分析系統(tǒng)。1.2象牙片制備與處理取直徑1.5cm的象牙毛胚，用鋸式切片機橫向切成50m薄片，置蒸溜水中超聲波清洗10min×3次，自然晾干，紫外線照射后保存于4冰箱中備用。1.3破骨細胞分離與培養(yǎng)參照文獻，取1日齡SD大鼠(由上海醫(yī)科大學放射醫(yī)學研究所實驗動物中心提供)，拉頸處死，75%酒精浸泡5min，無菌分離四肢長骨，剔凈軟組織，用Medium 199培養(yǎng)液清

5、洗2次，然后于Medium 199全培養(yǎng)液(含20%FBS、100g/ml硫酸鏈霉素、100/ml青霉素鈉，pH7.2)中，用解剖刀縱向剖開骨干，將骨質(zhì)內(nèi)表面刮入培養(yǎng)液，再以圓頭吸管吹打骨碎片5min，靜置30s，吸取上層細胞懸液均勻接種于預置有象牙薄片的24孔培養(yǎng)板中，每孔加培養(yǎng)液至1ml，37、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)30min，以Medium 199培養(yǎng)液沖去未貼壁的細胞，更換為全培養(yǎng)液至每孔2ml，每組4孔，繼續(xù)培養(yǎng)，3d更換1次培養(yǎng)液。1.4骨吸收陷窩定量分析分別于培養(yǎng)1、3、5、7d取出培養(yǎng)板中的象牙薄片各4張，2.5%戊二醛固定7min，于0.25mol/L氫氧化銨中超聲波清洗5mi

6、n×3次，系列梯度酒精脫水，自然涼干，1%甲苯胺藍染液室溫染色34min，蒸溜水清洗，于光鏡100倍下對整張象牙薄片上的吸收陷窩計數(shù)；然后對同一張象牙薄片再經(jīng)超聲波清洗10min×3次，常規(guī)處理后掃描電鏡300倍下對整張象牙薄片上的吸收陷窩計數(shù)。結果以陷窩數(shù)/片表示，組間進行線性相關分析。同等條件下每組隨機拍攝照片各6張，采用計算機象分析系統(tǒng)分別測算陷窩與背景面積的比值，以及陷窩的平均光密度值。     2結果2.1骨吸收陷窩的形態(tài)特征光鏡下，經(jīng)甲苯胺藍染色后吸收陷窩呈紫色或藍紫色，培養(yǎng)1d的象牙薄片上可偶見著色較淡的吸收陷窩，呈圓形

7、或橢圓形；3d時有臘腸形吸收陷窩出現(xiàn)；5d后吸收陷窩絕大部分呈梅花瓣形或臘腸形，邊界輪廓清晰，陷窩底部纖維紋路隱約可見(1-A)。掃描電鏡下觀察，骨吸收陷窩的變化趨勢與光鏡結果一致，同一標本可清楚識別形態(tài)相似的骨吸收陷窩，邊界輪廓清晰，陷窩底部粗糙，纖維紋路清晰可見(1)。接種在象牙薄片上的破骨細胞所形成的骨吸收陷窩。A：甲苯胺藍染色，骨陷窩呈紫色，邊界輪廓清晰，基底部纖維紋理隱約可見，×400。B：同一視野掃描電鏡觀察，骨陷窩輪廓一致，基底部纖維紋理清晰可見，×100。     1破骨細胞骨吸收陷窩的形態(tài)2.2骨吸收陷窩計數(shù)結果根據(jù)

8、上述骨吸收陷窩的特征，光鏡和電鏡下可清楚辨認骨吸收陷窩，計數(shù)結果基本一致，培養(yǎng)1d即有極少量的吸收陷窩出現(xiàn)，3d時稍有增多，5d后陷窩數(shù)量急劇增多。光鏡計數(shù)結果與電鏡計數(shù)結果進行相關分析(2)：相關系數(shù)r0.9998，P0.001。     2.3骨吸收陷窩面積分析結果對培養(yǎng)1d、3d、5d、7d的象牙薄片經(jīng)甲苯胺藍染色后，隨機拍攝照片各6張，采用計算機象分析系統(tǒng)勾畫出陷窩輪廓(3)，分別計算陷窩和背景的面積，結果以兩者的比值表示。隨著培養(yǎng)時間的延長，陷窩面積逐漸擴大(4)。     3骨吸收陷窩面積分析A：甲苯胺

9、藍染色的光鏡照片。×400。B：同一照片，由計算機象分析系統(tǒng)所勾畫出的陷窩輪廓。×400。     4骨吸收陷窩面積隨時間變化的趨勢(n6)2.4吸收陷窩深度分析對培養(yǎng)1d、3d、5d、7d的象牙薄片經(jīng)甲苯胺藍染色后，隨機拍攝照片各6張。由于陷窩著色深淺與其深度有關(5)，采用計算機象分析系統(tǒng)計算每張照片上陷窩的平均光密度值，以此反映陷窩的深度。結果顯示，培養(yǎng)13d陷窩深度變化不明顯，35d陷窩深度不斷加深，57d陷窩深度變化不明顯(6)。     5骨吸收陷窩深度分析A：甲苯胺藍染色的光鏡照片

10、，實心箭頭所示處著色深，空心箭頭所示處著色淺。×200；B：同一陷窩的掃描電鏡照片，實心箭頭所示處陷窩深，空心箭頭所示處陷窩淺。×300。     6骨吸收陷窩深度隨時間變化的趨勢(n6)3討論骨吸收陷窩觀察是評價體外培養(yǎng)破骨細胞功能的可靠方法之一，以往多在掃描電鏡下進行陷窩計數(shù)，其技術要求高、難度大，且費時費力，不便推廣。新近有研究者采用甲苯胺藍染色，骨吸收陷窩異染明顯，光鏡下可以清晰辨認其輪廓，計數(shù)結果與電鏡法具有良好的相關性1，本實驗取得了與之相近的結果，因此可以認為，骨吸收陷窩光鏡計數(shù)法能夠用于體外培養(yǎng)破骨細胞骨吸收功能的定量

11、評定。由于陷窩的大小不同，陷窩面積分析可以彌補計數(shù)方法所可能存在的缺陷28，通常是采用計算機像分析系統(tǒng)對隨機拍攝的同一批次陷窩照片進行分析，結果以陷窩面積與背景面積的比值表示。本實驗結果顯示，正常情況下，陷窩數(shù)量和面積隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加，變化趨勢基本一致，第1天陷窩少而面積小，前3天稍有增加和擴大，第5天以后無論是數(shù)量還是面積都明顯增多或擴大。破骨細胞吸收骨質(zhì)的過程中，通過移行不斷增加陷窩面積的同時，陷窩深度也在加深，對于一根被破骨細胞侵蝕的骨小梁而言，陷窩深度的不斷加深更易于引起小梁的穿孔和斷裂，因此，陷窩深度測量較之陷窩面積分析的意義有所不同。我們在實驗中觀察到，同一張象牙薄片經(jīng)

12、甲苯胺藍染色后，陷窩著色存在明顯的深淺差異，即便同一陷窩有時也存在類似現(xiàn)象，與掃描電鏡對照觀察發(fā)現(xiàn)，著色深的部位陷窩也較深，著色淺的部位陷窩則較淺，基于這一現(xiàn)象，通過計算機像分析系統(tǒng)，測定被甲苯胺藍異染的陷窩光密度值，然后再除以陷窩的面積，以陷窩的平均光密度值來間接反映其深度。實驗結果顯示，正常情況下，培養(yǎng)13d象牙薄片上的骨吸收陷窩深度較淺，且基本無變化，35d深度明顯增加，57d也基本無變化。這一方法的建立，為定量評定陷窩深度提供了一種新的嘗試。綜上，陷窩計數(shù)、面積和深度測定相結合，可以較為全面地評價體外培養(yǎng)破骨細胞的骨吸收功能，正常培養(yǎng)條件下，57d陷窩的數(shù)量明顯增多、面積擴大、深度加深

13、，因此，選擇加藥后第57d終止培養(yǎng)，可以觀察藥物干預的效果。致謝：本文細胞培養(yǎng)技術的學習得到上海醫(yī)科大學王洪復、金慰芳及高建軍的指導和幫助，謹致謝意!浙江省自然科學基金(NO399010)和國家九五攻關項目基金(NO969060905)資助詹紅生(浙江中醫(yī)醫(yī)院杭州310053)石印玉(上海中醫(yī)藥大學)趙詠芳(上海中醫(yī)藥大學)參考文獻2，Carano A,Teitelbaum SL,Konsek JD,et al.Bisphosphonates directly inhibit the bone resorption activity of isolated avian osteoclasts in vitro.J Clin Invest.1990,85(2):4564615，趙寧俠，于世鳳，龐淑珍.IL-l促進骨巨細胞瘤中破骨細胞樣細胞體外骨吸收研究.北京醫(yī)科大學學報，1998，30(3)：2462