1、    發作性睡病與HLA-DQB1*0602基因的相關性研究            作者：時間：2007-11-23 10:15:00                          &

2、#160;  作者;蔣天舒，周曄，陳 燕，陳 波，谷明莉，鄧安梅，仲人前摘要  目的  探討發作性睡病與HLA-DQB1基因的相關性。方法  對30例發作性睡病患者的臨床資料進行分析。用序列特異性引物-聚合酶鏈反應（PCR-SSP）分型技術測定HLA-DQB1等位基因''并與44例健康人檢測的數據進行比較。 結果  發作性睡病患者組DQB1*0602基因頻率為40%，與正常對照組9.09%相比較明顯增高；未檢出DQB1*0401-0402基因，與正常對照組9.09%相比較，經統計學分析，差異有顯著性（P<0.05

3、）。結論  HLA-DQB1*0602基因為中國發作性睡病人群的易感基因；HLA-DQB1*0401-0402基因為中國發作性睡病人群的保護基因。        關鍵詞  發作性睡病;HLA基因;易感性        Study on the association between HLA-DQB1*0602 genes and narcolepsy        JIANG Tian-shu &

4、#39;'ZHOU Ye'' CHEN Yan''et al. Labortary Diagnostics'' Changzheng Hospital''Second Military Medical University''and Clinical Immunology Center of PLA'' Shanghai 200003'' China        Abstract  Objective&#

5、160; To investigate the association between HLA-DQB1 genes and narcolepsy. Methods  HLA typing were performed in 30 patients with narcolepsy by HLA-DQB1 resolution PCR-SSP（sequence specific primers）''then the frequencies of alleles were analyzed compared with normal controls.Result

6、s  The frequencies of DQB1*0602 in narcolepsy were significantly higher than normal controls（40% versus 9.09%）''while the frequency of DQB1*0401-0402 was markedly lower（0 versus 13.64%）. Conclusion  HLA-DQB1*0602 were susceptible alles for narcolepsy while  HLA-DQB1*0401-

7、0402 may be protective.        Key words  narcolepsy;HLA genes;susceptible        發作性睡病（narcolepsy）是一種常見于青春期前起病，并持續終生的慢性神經系統疾病。臨床以不可抗拒的白天睡眠過多為特征''尚可合并猝倒、入睡幻覺和睡眠癱瘓1。近年來國外已有關于發作性睡病與HLA抗原基因相關性的研究報道2''3。本病對患者身心健康及生活質量有很大影響。

8、本病病因不明，其發生可能是環境因素與遺傳因素相互作用的結果4。我們用聚合酶鏈反應-序列特異性引物（PCR-SSP）方法對HLA-DQB1等位基因進行檢測，對它們在特異性發作性睡病及正常人的分布進行比較，以了解它們與特異性發作性睡病遺傳易感性的關系。        1  材料與方法        1.1  研究對象  特異性發作性睡病組：中國漢族患者30例，其中男24例，女6例；年齡940歲，平均18歲。全部患者經詳細詢問及查體，腦電圖、頭顱CT和

9、（或）MRI檢查無異常所見，確診為發作性睡病。對照組：為與患者同地區的、與患者無血緣關系的、無特異性發作性睡病發病史的健康人群，共44例。        1.2  實驗材料         主要試劑  Taq DNA聚合酶（Promega公司）、Qiagmp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN公司）、HLA-DQB1基因分型試劑盒（ONE-LAMBDA公司）。       

10、;  主要儀器  PCR自動擴增儀（GeneAmp 9600''PE''USA）、微量凝膠電泳系統（Abgeme，英國）、紫外分光分析系統（MultiImageTM''Aipha Innotech Corporation）。        1.3  診斷標準  參照睡眠障礙國際分類（ICSD）5，6''并結合發作性睡病的臨床特征：（1）患者有白天過度嗜睡或突然肌無力主述。（2）每天有頻繁小睡或突然進入睡眠狀態。（3）情感誘發致突然雙

11、側肌張力消失（猝倒）。（4）多導睡眠圖（polisomnography，PSG）記錄：睡眠潛伏期<10 min；REM睡眠潛伏期<20 min；多次小睡時間MSLT中平均睡眠潛伏期<5 min；兩次以上睡眠開始時REM發作。        1.4  實驗方法        基因組DNA的制備  應用DNA提取試劑盒抽提外周血白細胞中的DNA。取2 l的DNA樣品，用紫外分光光度法檢測樣品的A值及純度，最后DNA調準為100 g/ml。&#

12、160;      實驗方法  應用PCR-SSP（polymerase chain reaction/sequence primers）方法檢測HLA-DQB1位點的基因型。基因頻率采用直接計算法。按Woolf公式計算相對風險度（RR）來評估該病與等位基因的關聯強度。2檢驗對RR進行顯著性檢驗。PC<0.05為差異有顯著性。將含有DNA、Taq DNA聚合酶、PCR-Mix的混合液以每孔10 l的量加入HLA-DQB1基因分型板的32個含特異性引物的小孔；以每孔12 l的量加入HLA-DQB1基因分型板的32個含特異性引物的小孔。PCR

13、擴增條件為96 預變性130 s，63 退火和延伸60 s，1個循環；96 變性10 s，63 退火和延伸60 s，9個循環；96 變性10 s，59 退火50 s，72 延伸30 s，20個循環。        基因型的確定  以2%的瓊脂糖凝膠電泳，90V穩壓15 min。紫外燈下觀察，根據PCR產物的有無及分子量大小對照HLA-DQB1基因分型格局表確定基因型別。        1.5  統計學方法  用直接計數法計算基因頻率。兩組間基因頻

14、率的比較采用2檢驗。P值均用Bonferron法進行校正P值（Pc）''Pc<0.05有統計學意義。        2  結果        發作性睡病患者組和正常對照組HLA-DQB1基因頻率的分布：發作性睡病組DQB1*0602基因頻率（40%）較正常對照組（9.09%）增高（2=20.11，P<0.05 ）；在發作性睡病組中未檢出DQB1*0401-0402''基因頻率較正常對照組（13.64）明顯降低，經

15、統計學分析差異有顯著性（2=7.168''P<0.05）。見表2。 表2  HLA-DQB1基因在發作性睡病與正常對照組中的分布     3  討論        HLA類分子在自身反應性T細胞的成熟中以及T細胞活化和免疫識別中起重要作用。HLA具有高度多態性，不同的HLA分子因結構上的差別，特別是抗原結合部位上某些氨基酸殘基的不同，在一定程度上決定了HLA分子對自身抗原的親和力，從而直接影響它們遞呈抗原肽并激活特異性T細胞的能力。HLA類抗原分子多態性

16、的氨基酸序列主要存在于分子外側功能區的3個超變區中，這種多態性決定了不同HLA類分子與抗原結合部位即裂隙的細微差別，并且影響與抗原肽的結合。在HLA分子、抗原肽及T細胞受體三分子復合物的相互作用中''因為某些原因機體不能區分自我和非我''導致自身免疫反應的發生。據此推測，可能是這一類將自身抗原遞呈給抗原特異性T細胞的特殊HLA分子攜帶著發作性睡病的遺傳易感性，且可影響病情進展。        本研究采用PCR-SSP方法對HLA-DQB1等位基因進行了檢測，結果發現HLA-DQB1*0602在發作性睡病

17、及正常對照組中的基因頻率分別為40%和9.09%，經統計學分析，差異有顯著性 （2=7.168''P<0.05）。此結果進一步證實了HLA-DQB1*0602為發作性睡病的易感基因，與國外相關報道一致710。在發作性睡病組中未檢出HLA-DQB1*0401-0402''而該基因在正常對照組中的頻率為13.64%，經統計學分析差異有顯著性。這說明HLA-DQB1*0401-0402可能為該病的保護基因。不同的HLA類基因產物參與遞呈不同的抗原肽，并誘發出特異性和強度不同的免疫應答。HLA-DQB1*0602可能在免疫應答過程中起重要的調控作用，使T細胞激活，

18、導致免疫反應增強，參與發作性睡病病變的形成。HLA-DQB1*0401-0402在免疫反應的調控過程中可能起到負反饋作用，導致具有不同HLA類抗原等位基因的免疫應答能力和對發作性睡病易感性的差異。        HLA-DQB1*0401-0402可能為該病的保護基因，這在過去的研究中從未提及，也許是我們HLA-DQB1高分辨的分型，使分型更為細致所發現，也可能因為過去研究例數較少所致。在中國人群中，發作性睡病患病率只有0.04%左右11，12。本研究亦顯示，中國發作性睡病患者與DQB1*0602存在一定的相關性，但要對發作性睡病患者

19、做進一步的診斷、治療，尚需更深層次的探索。參考文獻    1  Kotagal S''Hartse K    M'' Walsh JK. Characteristics of narcolepsy in preteenaged children. Pediatrics''1990''85:205-209.        2  Kawashima M'' Tamiya

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