1、影響禽流感血凝-血凝抑制試驗的主要因素鐘蘊珠，肖國雄（梅縣動物衛生監督所，廣東梅縣514700）摘要：禽流感血凝-血我抑制試臉因其具有簡便、快速、準確、實用的特點，在縣級獸醫實驗室被廣泛應用.但在試驗過程中，人為因素的影響很大，常常因為操作不規范等，導致試驗結果不準確，甚至失敗.關鍵詞：禽流感；血凝；血凝抑制；影響因素中圖分類號：S852.4'5文獻標識碼：A文章編號：1005-8567（2013）06-0050-02禽流感血凝-血凝抑制試驗是目前WHO和0IE進行全球流感監測所普遍使用的試驗方法，可用于禽流感亞型抗體水平的檢測和流感分離株HA亞型鑒定。該試驗因其具有簡便、快速、準確、

2、實用的特點，在縣級獸醫實驗室被廣泛應用于禽流感亞型抗體水平的檢測。但在試驗過程中，人為因素的影響很大，常常因為操作不規范等，導致試驗結果不準確，甚至失敗。現就試驗過程中常見的幾個主要問題總結如下。1試劑問題PBS的PH值試驗用的pH7.2、0.01mol/LPBS應按要求配制、調好pH值。pH值偏酸，易使紅細胞自凝，偏堿則易使凝集的紅細胞洗脫加快，從而影響試驗結果的判定。1.1 1%紅細胞懸液的制備由于不同個體雞只紅細胞對病毒的敏感性不同而影響血凝抑制（HD效價，所以一般采用3只以上健康公雞的紅細胞混合使用，最好選用非免疫公雞。如果選用免疫公雞代替，則需增加洗滌次數和時間。在最后定容時，離心時

3、間要超過15min,以便壓實紅細胞泥、準確讀數。一般紅細胞濃度偏低,HI滴度下降；紅細胞濃度偏高,HI滴度上升。1.2 4個血凝單位（HAU）抗原的配制4個血凝單位（HAC）抗原需現配現用。工作抗原效價的測定至關重要，抗原效價過高過低都對試驗結果有著很大的影響。效價過高，則HI滴度偏低;效價過低，則H1滴度偏高。為保證4個血凝單位抗原的配制準確無誤，必須做抗原回歸試驗：在微量反應板的1-4孔均加入0.025mLPBS；取4HAU混勻的抗原液0.025mL加入到第1孔中，混勻，然后倍比稀釋到第4孔，從第4孔中吸取0.025mL棄之：每孔均加入0.025mL1%雞紅細胞懸液。振蕩混勻,室溫下靜置約

4、40min后觀察結果一若前2孔完全凝集（第2孔為完全凝集的終點），則視為抗原配置正確（見圖1）。圖14HAU抗原回歸試驗2非特異性凝集因子在進行鴨、鵝等水禽的禽流感抗體檢測時，若使用雞而非相應的鴨或鵝的紅細胞懸液，則水禽血清中可能存在的，對雞紅細胞有非特異性糅集作用的因子，使試驗出現雞紅細胞不流淌或流淌不完全（非特異性凝集的滴度多集中在（1-3）log2,個別甚至達到61og2）,嚴重干擾了結果的判定（見圖2）。因此,最好采用與被檢血清同種禽類的紅細胞來進行抗體效價的檢測。若無同類水禽紅細胞，則可用雞紅細胞吸附法對水禽血清進行處理，以除去非特異性凝集素。處理方法為：每圖2非特異性凝集現象圖2非

5、特異性凝集現象0.5mL的血清中加入0.025mL的雞紅細胞，輕搖后靜置至少30min；800r/min離心約25min,收集上清液即為處理后的血清。3微量反應板的清洗反應板不潔凈、不光滑，都會直接影響試驗的結果。使用過的反應板先用流水沖凈孔中的反應物,然后浸泡在清潔液中(新反應板可直接放入清潔液中浸泡)，24h后取出，用流水沖洗干凈后，再在蒸飼水中沖洗1遍，甩干，擺放在恒溫箱中，70°C以下烤干備用。4環境溫度的控制試驗感作溫度，從4C到37C,隨著溫度上升，HA與HI滴度上升，但在37.C時，凝集的紅細胞容易洗脫,4.C紅細胞易產生自凝。溫度過高，試驗結果出現快，但凝集解脫也快，

6、使整個反應板凝集現象消失：溫度過低，則試驗結果出現慢。故試凝環境溫度應按規范要求控制在室溫2025,Co5其它應注意的問題5.1加樣時應細致認真，避免樣品、試劑加在孔壁上或濺出板孔:移液器吸頭應垂直加入液體，要保持吸頭管嘴與凝集板孔間的距離，不能與孔內液面接觸，以免產生污染。5.2稀釋血清時，速度不能過快，吸頭不要離開液面，以免產生氣泡，造成移液量不準確，影響試驗結果。5.3病毒懸液和紅細胞懸液如沒有搖勻，加入時濃度高低不一，會人為造成誤差。因此，抗原和紅細胞使用前-定要搖勻，保證每一孔中加入的濃度準確一致。紅細胞懸液應輕輕慢搖，避免劇烈搖動，以免造成紅細胞破裂。試驗操作中不僅要嚴格按照規定的

7、操作方法操作、細致耐心，更要在一些操作技巧和熟練程度上下功夫，同時綜合考慮各方面的因素，發現問題及時糾正處理，這樣才會獲得滿意的試驗結果。(上接第47頁)檢測與分析。4討論豬場可結合豬瘟抗體檢測報告，選擇適合自己豬場使用的疫苗。超前免疫后應在6070日齡時加強接種1次。豬瘟病毒嚴重污染地區還應在25-30H齡時再接種1次。定期檢查并淘汰帶豬痕野毒的母豬，對于豬瘟的防控至關重要。這樣的母豬不僅會使胚胎期或出生前仔豬感染豬瘟病毒而致免疫失敗，同時又是豬群持續發生非典型性豬瘟的根源，其后患無窮，必須給予高度重視。為了便于管理，可使用白天分娩技術。建議經產母豬在預產期前23天的早上68時，每頭母豬肌注氯前列烯醇0.2mg來調控母豬于白天分娩，有利于仔豬的豬瘟超前免疫,減少超前免疫失敗的兒率。但要注意母豬的預產期推算-淀要準確。參考文獻：1 程鐵城.規模化豬場消滅豬瘟的措施LH.北京農學院學報，1993,8(2):