1、分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法和技巧分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法和技巧張照康張照康20162016年年5 5月月31 31日日PCR原理A瓊脂糖凝膠電泳B細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)CLOREM IPSUM DOLORP C R P C R 原理原理P C R P C R 原理原理DNADNA半保留復(fù)制半保留復(fù)制是DNA在進(jìn)行復(fù)制的時(shí)候鏈間氫鍵斷裂，雙鏈解旋分開，每條鏈作為模板在其上合成互補(bǔ)鏈，經(jīng)過一系列酶（DNA聚合酶、解旋酶、鏈接酶等）的作用生成兩個(gè)新的DNA分子。子代DNA分子其中的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種方式稱半保留復(fù)制。P C R P C R 原理原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（英文全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（英

2、文全稱：Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction），），簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱PCRPCR。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。P C R P C R 原理原理PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫

3、時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。P C R P C R 原理原理PCRPCR工作原理工作原理PCR由變性退火(復(fù)性）延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板模板DNADNA的變性的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板模板DNADNA與引物的退火與引物的退火( (復(fù)性復(fù)性) )：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至4060左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)

4、序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸引物的延伸：DNA模板與引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。P C R P C R 原理原理P C R P C R 原理原理模板來源模板來源目標(biāo)生物的細(xì)胞，組織，個(gè)體等具有活細(xì)胞組織中提取。P C R P C R 原理原理設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度：15-

5、30bp，常用為20bp左右； 引物擴(kuò)增長(zhǎng)度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增至10kb的片段； 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。 P C R P C

6、 R 原理原理酶，酶，dNTPdNTP（原料）（原料） 公司購(gòu)買公司購(gòu)買P C R P C R 原理原理儀器：儀器：P C R P C R 原理原理1、加樣P C R P C R 原理原理 2、PCR瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳法分離瓊脂糖凝膠電

7、泳法分離DNA主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系，因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離，該過程可以通過把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇主要的實(shí)驗(yàn)操作步驟如下： 將完全細(xì)胞培養(yǎng)液（500ml DMEM+50ml FBS+5ml 青霉素/鏈霉素）放入37水浴鍋中預(yù)熱15-30分鐘。同時(shí)將窗鏡臺(tái)的紫外打開照射； 將以前凍存在液氮管中的細(xì)胞取出來，快速的放入37水浴鍋中融化，融化期間要不停的輕輕晃動(dòng)細(xì)胞凍存管，加速細(xì)胞的融化，融化時(shí)間大約為2-3min； 將

8、細(xì)胞凍存管用75%的酒精滅菌，然后將細(xì)胞凍存管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個(gè)裝有10ml的離心管中，然后用移液槍一滴一滴的加入細(xì)胞培養(yǎng)液，在此過程中不斷輕輕晃動(dòng)10ml離心管，使其混勻； 將10ml離心管封口，然后放入離心機(jī)中，室溫800g，離心時(shí)間3min； 將10ml離心管用75%的酒精滅菌，然后放入窗鏡臺(tái)中，用吸液器將細(xì)胞培液吸掉，在用新鮮培液將細(xì)胞沉淀輕輕吹打均勻，轉(zhuǎn)移至6cm細(xì)胞板中，前后左右輕輕晃動(dòng)幾下； 將復(fù)蘇好的細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6-8小時(shí)后換一次培養(yǎng)液（6h后細(xì)胞基本上貼壁），然后繼續(xù)培養(yǎng)。注：每一個(gè)拿進(jìn)窗鏡臺(tái)的東西都要用75%的酒精擦拭一遍，防止污染細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)

9、胞傳代細(xì)胞傳代一般是當(dāng)細(xì)胞的貼壁密度為70-90%左右的時(shí)候進(jìn)行傳代。主要的實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：將完全細(xì)胞培養(yǎng)液（500ml DMEM+50ml FBS+5ml 青霉素/鏈霉素）、0.25%胰酶以及1xPBS放入37水浴鍋中預(yù)熱15-30分鐘。同時(shí)將窗鏡臺(tái)的紫外打開照射；用75%酒精擦拭手套、窗鏡臺(tái)臺(tái)面、細(xì)胞培養(yǎng)液瓶、胰酶瓶以及1xPBS瓶；將細(xì)胞培養(yǎng)皿從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出來，放入窗鏡臺(tái)中，用吸液器將細(xì)胞培養(yǎng)液吸掉，加入適量的1xPBS，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)皿；用吸液器將1xPBS吸掉，然后加入適量的0.25%胰酶，然后放入37培養(yǎng)箱消化1-5min，根據(jù)細(xì)胞貼壁性能確定時(shí)間；細(xì)胞從壁上消化下來后，用

10、移液槍輕輕吹打細(xì)胞，使其消化成為單個(gè)細(xì)胞，然后加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，終止細(xì)胞消化；將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中，然后將15ml離心管轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中，室溫800g，離心3min；將15ml離心管用75%的酒精滅菌，然后放入窗鏡臺(tái)中，用吸液器將細(xì)胞培液吸掉，在用新鮮培液將細(xì)胞沉淀輕輕吹打均勻，轉(zhuǎn)移適量比例的細(xì)胞至幾個(gè)10cm細(xì)胞板中，前后左右輕輕晃動(dòng)幾下，使其均勻鋪板；將已經(jīng)傳代好的細(xì)胞放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞凍存細(xì)胞凍存首先配置新鮮的凍存液：90%的完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS（FBS可以適量的增加至20%）+5%青霉素與鏈霉素）+10%D

11、MSO（DMSO需要過濾除菌）；凍存步驟和傳代步驟類似，用75%酒精擦拭手套、窗鏡臺(tái)臺(tái)面、細(xì)胞培養(yǎng)液瓶、胰酶瓶以及1xPBS瓶；將細(xì)胞培養(yǎng)皿從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出來，放入窗鏡臺(tái)中，用吸液器將細(xì)胞培養(yǎng)液吸掉，加入適量的1xPBS，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)皿；用吸液器將1xPBS吸掉，然后加入適量的0.25%胰酶，然后放入37培養(yǎng)箱消化1-5min，根據(jù)細(xì)胞貼壁性能確定時(shí)間；細(xì)胞從壁上消化下來后，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞，使其消化成為單個(gè)細(xì)胞，然后加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，終止細(xì)胞消化；將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中，然后將15ml離心管轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中，室溫800g，離心3min；將15ml離心管用75%的