1、granmr14.doc第六章 同核核磁實驗方法通常所謂同核核磁譜指的是1H同核譜，因為一般有機物富含氫，而1H的天然豐度達99.98%，而且1H的旋磁比最大，因而核磁信號最強。其他核的核磁信號的檢測相對來講都比較困難，尤其是蛋白質(zhì)中有意義的如13C，15N的天然豐度分別只有1.11%和0.36%,相對1H的檢測靈敏度只有0.0159和0.00104，因此要檢測蛋白質(zhì)中的13C及15N一定要有同位素標記才行，而且還需長時間累加。一般同核譜可研究的蛋白質(zhì)分子量的上限在1萬左右，當然還要求蛋白質(zhì)在溶液中有足夠的溶解度，化學位移的分布比較分散。蛋白質(zhì)中質(zhì)子的化學位移基本上是random coil的化

2、學位移加上不同構(gòu)象的影響。如b折疊多的蛋白質(zhì)同a螺旋多的蛋白質(zhì)相比，化學位移更為分散，譜峰也更容易解析；同種氨基酸殘基多的蛋白質(zhì)，即使分子量較小，由于化學位移可能會比較密集，譜峰解析可能比稍大一些的蛋白質(zhì)還要困難。已經(jīng)發(fā)表的脈沖序列有上百，但通?？梢钥醋鞒Ｒ?guī)實驗的為數(shù)不多。6.1 一維氫譜在記錄二維譜或三維譜等之前均需要記錄一維氫譜，通常蛋白質(zhì)溶于水或適當?shù)木彌_液，加5-10%的D2O作為鎖場介質(zhì)。一維氫譜可用于檢查樣品是否有足夠濃度，通常1632次采樣要能得到足夠信噪比的譜圖，甲基由于快速旋轉(zhuǎn)呈現(xiàn)窄峰，而酰胺質(zhì)子由于化學交換及14N的標量弛豫呈現(xiàn)寬峰；一維氫譜還可用于檢查樣品的共振峰寬是否合

3、理，蛋白質(zhì)在高濃度下容易聚集從而增寬譜線，嚴重時甚至1H譜上看不到明顯的峰，樣品在這種條件下顯然無法進行核磁研究；一維氫譜還可用于判別樣品的化學位移分布情況，可判別樣品是否變性，同時也對研究工作的難度提供一些預(yù)測。上圖顯示ubiquitin（一種蛋白質(zhì)，76個殘基）的一維譜：a 水溶液中，b 箭頭所指甲基區(qū)的放大，c 8M尿素溶液中，顯示變性譜。蛋白質(zhì)的一維氫譜一般不應(yīng)該有非常尖的峰，若出現(xiàn)這種峰，往往是殘留的小分子雜質(zhì)，當然蛋白質(zhì)的末端及l(fā)oop區(qū)由于分子運動較快也會出現(xiàn)一些較尖的峰。當樣品條件不佳時，一維譜（以及若干信號強的二維譜）可用來探索適合的樣品條件。6.2 COSY型實驗6.2.1

4、 COSYA COSY(correlated spectroscopy),是人們發(fā)明的第一種二維譜，同時也是研究蛋白質(zhì)的最有用的二維譜之一。二個有J偶合的核在COSY上可產(chǎn)生一個交叉峰，由于蛋白質(zhì)（包括多數(shù)其他有機物）中有J偶合意味著這兩個核最多通過3個共價鍵連接，所以COSY譜對于分子結(jié)構(gòu)的拓撲連接可提供非常有價值的信息。左圖是COSY的脈沖序列，只由2個90度脈沖組成，兩脈沖之間是演化期，理想脈沖本身不產(chǎn)生其他雜信號，故不需相循環(huán)抑制：因此基本的相循環(huán)為：f1=x;f2=x;fref=x實際上由于演化期的弛豫以及第一個90度脈沖的不準確會產(chǎn)生軸峰，需要用2步循環(huán)抑制：第一個脈沖及接收機相位

5、同時反轉(zhuǎn)通常還加上CYCLOPS循環(huán)以抑制硬件不平衡產(chǎn)生的其他雜信號這樣形成8步循環(huán)：f1=0 2 1 3 2 0 3 1f2=0 0 1 1 2 2 3 3fref=0 2 1 3 2 0 3 1二維譜有幅度譜和相敏譜之分，由于相敏譜的分辨率高，通常要盡量用相敏譜。B 以下是可以在Bruker核磁譜儀上用于記錄蛋白質(zhì)COSY譜的脈沖程序，脈沖序列在Bruker譜儀上稱作微程序:;cosyprst.WJH#include <Avance.incl>“p2=p1*2”“d0= in0/2 - p1*4/3.14159”“d11=30m”“d12=20u”“d13=3u”“l(fā)3=(td

6、1/2)”1 ze2 d113 d114 d12 pl9:f1 d1 cw:f1 d13 do:f1 d12 pl1:f1 p1 ph1 d0 p1 ph2 go=2 ph31 d11 wr #0 if #0 ip1 zd lo to 3 times 2 d11 id0 lo to 4 times l3exitph1= 0 2 2 0 1 3 3 1ph2= 0 0 2 2 1 1 3 3ph31=0 2 2 0 1 3 3 1C 脈沖序列分析a 二自旋體系考慮相循環(huán)的第一步第一項為縱向磁化，第二項為多量子項，均不能被觀測到；第三項仍然是第一核的橫向磁化，在檢測期的頻率同演化期類似，均是第一核

7、的，對應(yīng)于對角峰；第四項是第二核的反向磁化，在檢測期的頻率為第二核的化學位移，與演化期不同，對應(yīng)于交叉峰，這是二維譜最有意義的峰。進一步將后兩項的系數(shù)分解：可見，對角峰在F1維位于W1，同相裂分成兩個成分，距離2pJ12；而交叉峰在F1維也位于W1，但反相裂分成兩個成分，距離也是2pJ12。由于一個信號為正弦調(diào)制，另一個為余弦調(diào)制，對角峰信號與交叉峰信號在相位上相差90度，故在F1維兩者不能同時調(diào)相成吸收型信號。再看F2維，對角峰為同向磁化，在檢測期呈現(xiàn)同相裂分，距離2pJ12；交叉峰在F2維為反向磁化，在檢測期呈現(xiàn)反相裂分，距離也是2pJ12。由于一個信號在x方向，另一個在y方向，兩者在相位

8、上也相差90度，故在F2維兩者也不能同時調(diào)相成吸收型信號。COSY的交叉峰為反相峰，這一點非常重要，決定了COSY型實驗采樣及處理時需要注意的問題。而交叉峰與對角峰在相位相差90度，對于譜圖在對角線附近的質(zhì)量有重要的影響。b 多自旋體系考慮I1和I2間的交叉峰，類似的計算可得其系數(shù)為：其中的余弦項表明在F1維第一核相對除第二核（稱為主動偶合）外的其他核（稱為被動偶合）呈現(xiàn)同相裂分；同樣在F2維由于交叉峰的密度算符為第二核相對第一核的反相磁化，其中沒有出現(xiàn)被動偶合核的算符，即相對于被動偶合核為同相磁化，因此也呈現(xiàn)同相裂分。當其中一個核為甲基時，由于磁全同的緣故，出現(xiàn)多重裂分：同相峰可用pasca

9、l三角形描述；反相峰用反pascal三角形描述。D 實驗方案同其他二維譜相同處如確定譜寬，照射頻率，測定90度脈寬，選擇循環(huán)延遲時間等反相譜的特殊處1 由于兩維的交叉峰均是反相峰，因此兩維都要有足夠的分辨率，否則正負兩部分的信號產(chǎn)生部分重疊，而使信號減弱；2 交叉峰的觀測信號包含，由于同核偶合常數(shù)不大，通常幾Hz至十幾Hz，因此t1及t2的最大值要達到至，這樣才能獲得足夠強度的信號，這相當于62-125ms（假定4Hz的偶合常數(shù)）。對于t2一般不成問題，但t1則不然：因為t1的增量由譜寬確定，t1的最大值越大意味著F1維的數(shù)據(jù)點數(shù)也越大，而實驗時間與F1維點數(shù)成正比。對一般蛋白質(zhì)而言，通常置照

10、射頻率在水峰處，譜寬大致10ppm，接近5000Hz，因此t1的增量為0.2ms，若F1維點數(shù)取512，t1的最大值可達50ms左右；若F1維點數(shù)取1024，t1的最大值可達100ms左右。因此一般F1維點數(shù)取512至1024。左圖顯示不同F(xiàn)1維點數(shù)的效果：a t1max=69ms,NS=16;b t1max=34.5ms,NS=32;c t1max=17.2ms,NS=64E 數(shù)據(jù)處理通常交叉峰總是調(diào)相成吸收線型，此時對角峰呈色散線型。由于色散峰的長拖尾對靠近對角線的交叉峰產(chǎn)生干擾，所以必須加適當?shù)拇昂瘮?shù)，通常以不帶相移或略有相移的正弦函數(shù)或正弦平方函數(shù)。左圖顯示不同相移的正弦窗函數(shù)作用于F

11、1維的效果：a 30度; b 20度; c 10度; d 5度F 應(yīng)用在高場區(qū)由于化學位移的簡并，譜峰的重疊，對角峰的干擾，通常不容易由COSY辨認整個自旋系統(tǒng)，在蛋白質(zhì)COSY特別有用處是用于檢查所謂的指紋區(qū)特別是酰胺質(zhì)子與a質(zhì)子的交叉峰。在這個區(qū)域，脯氨酸由于沒有氨基沒有交叉峰；甘氨酸有兩個a質(zhì)子故有兩個交叉峰（除非兩者的化學位移相同）；N端殘基上的NH由于與水交換快也沒有交叉峰。除特殊情況外，對于不大的蛋白質(zhì)，所有的峰都應(yīng)該能找到。蛋白質(zhì)COSY上的幾個主要區(qū)域leucine,isoleucine,valine側(cè)鏈交叉峰alanine,threonine甲基區(qū)1HN-1Ha指紋區(qū)G J偶

12、合常數(shù)的測量在沒有被動偶合時，COSY的精細結(jié)構(gòu)可以用于測定J偶合常數(shù)，但直接由譜峰的裂分得到的值有較大的誤差。顯示表觀裂分與線寬的關(guān)系H COSY的變型1 COSY-b第二個90度脈沖用小于90度的脈沖代替，其結(jié)果是：對角峰被減弱多核體系中被動偶合產(chǎn)生的某些交叉峰被減弱，導(dǎo)致精細結(jié)構(gòu)的變化，起到簡化圖譜的作用上圖比較COSY-35同普通COSY的圖譜，GLY的1HN-1Ha交叉峰結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因而有利于J偶合常數(shù)的測定2 pre-TOCSY COSY預(yù)飽和同時抑制接近水峰的aH信號，因而從aH到其他質(zhì)子特別是NH的交叉峰減弱甚至消失，而NH到aH的交叉峰往往淹沒在水峰產(chǎn)生的t1噪聲中。在pr

13、e-TOCSY COSY中，在COSY序列前插入一個短時間的TOCSY混合脈沖，使其他質(zhì)子的信號先傳遞給aH，這樣可部分恢復(fù)aH到其他質(zhì)子的信號。6.2.2 Relayed COSY(R-COSY)A 所謂接力譜，COSY的一種擴展，在COSY的二個脈沖后加一個延遲，使反向磁化進一步傳遞給第三個核，最后一個90度脈沖完成第二核至第三核的相干傳遞，這樣觀測的第一核同第三核的交叉峰，雖然兩者可能并沒有J偶合。顯然，接力譜中的交叉峰表明兩個自旋同屬一個自旋系統(tǒng)。左圖為R-COSY的脈沖序列，基本相循環(huán)為8步：f1=0 2 0 2 0 2 0 2f2=0 0 0 0 2 2 2 2f3=0 0 0 0

14、 0 0 0 0f4=0 0 2 2 0 0 2 2fref=0 2 0 2 0 2 0 2整個循環(huán)由二步f1，二步f2，二步f4組成，而fref=f1，選擇條件變成，即，由于三者均是完整的二步循環(huán)，因此得選擇的相干傳遞途徑為：Dp1=±1; Dp2=0,±2; Dp4=0,±2需要時可加上CYCLOPS擴展成32步循環(huán)B 脈沖序列分析考慮三核體系，1，2核間以及2，3核間有J偶合，而1，3核間無J偶合。同樣只考慮第一步相循環(huán)。經(jīng)過前二個脈沖作用，第一核產(chǎn)生的信號如COSY中所計算，在回波序列的作用下：最后一個90度脈沖產(chǎn)生:其中第4項是不可觀測信號，第6項為接力信號，這個信號在F2維位于W3