1、xxxxxxx中藥飲片廠微生物限度檢查法標準操作規程編號 ZL·SOP·05·062-01頁 數共 9 頁制定人制定日期 年 月 日修訂日期 年 月 日 審核人審核日期 年 月 日頒發部門質量管理部批準人批準日期 年 月 日生效日期年 月 日分發部門質量管理部、質量控制科目 的  建立微生物限度檢查法標準操作規程，規范操作，保證結果的準確性。范 圍  成品、輔料、內包裝袋及純化水的檢驗。責 任  微生物限度檢驗人員 內 容   本檢驗操作規程依據中國藥典2015年版

2、四部通則1105  非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法和通則1106  非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法進行檢查。 微生物計數法 一、計數方法 1、微生物計數法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數。2、計數方法 本法包括平皿法、薄膜過濾法。 3、計數培養基適用性檢查和供試品計數方法適用性檢查      供試品微生物計數中所使用的培養基應進行適用性檢查。供試品的微生物計數方法應進行方法適用性試驗，以確定采用的方法適合于該產品的微

3、生物計數。4、菌種及菌液的制備  4.1試驗用菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0袋），并采用適宜的菌種保藏技術進行保藏。計數培養基適用性檢查和計數方法適用性試驗。  4.2菌液制備  按規定培養各試驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養物，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。采用適宜的方法吸出孢子懸液至

4、無菌試管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2-8，可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2-8，在驗證過的貯存期內使用。 4.3陰性對照  為確認試驗條件是否符合要求，應進行對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。 4.4培養基適用性檢查  按照表規定，接種不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養基或胰酪大豆胨瓊脂培養基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板，置規定的條件下培養。每一試驗菌株

5、平行制備2管或2個平皿。同時用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。被檢固體培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值應在0.5-2范圍內，且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致。被檢液體培養基管與對照培養基管比較，試驗菌應生長良好。 5、計數方法適用性檢查 5.1供試品制備   根據供試品的理化特性與生物學特性，采用適宜的方法制備供試液。制備時若需加溫應加熱均勻且溫度不得超過45。供試液從制備到加入檢驗用培養基不得超過1小時。5.1.1成品、輔料供試液的制備   取供試品，加PH7.0無菌氯化鈉

6、-蛋白胨緩沖溶液或PH7.2磷酸鹽緩沖溶液，或胰酪大豆胨液體培養基或稀釋制成1:10供試液，若需要，調節供試液PH至6-8，必要時用同一稀釋液將供試液進一步10倍稀釋系列。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。  5.1.2內包裝膜、袋：取供試品100cm2，剪碎，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或PH7.2磷酸鹽緩沖溶液，或胰酪大豆胨液體培養基，浸泡，振搖，制成1:10供試液。若需要，調節供試液PH至6-8，必要時用同一稀釋液將供試液進一步10倍稀釋系列。 5.2接種和稀釋  按下列要求進行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗用供試液。

7、所加菌液的體積應不超過供試液體積的1%。為確認供試品中微生物能被充分檢出，應首先選擇最低稀釋級的供試液進行計數方法適用性試驗。 5.2.1試驗組   取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每1ml供試液所含菌量不大于100cfu。  5.2.2供試品對照組  取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作。5.2.3菌液對照組   取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。  5.3供試品中微生物的回收  

8、60;表1所列的計數方法適用性試驗的各試驗菌應逐一進行微生物回收，微生物回收采用平皿法。  5.3.1平皿法  采用傾注法，表1中每株試驗菌每種培養基至少制備2個平皿。取照上述“供試液的制備”和“接種和稀釋”制備的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15-20ml溫度不超過45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養、計數。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌液，計算各試驗組的平均菌落數。  5.3.2薄膜過濾法  采用的濾膜孔徑不大于0.45um。濾膜直徑一般為50mm。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方

9、法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量不超過100ml，總沖洗量不得超過1000ml；以免濾膜上的微生物受損傷。  取照上述“供試液的制備”和“接種和稀釋”制備的供試液適量（一般取相當于1g、1ml、10cm2的供試品，若供試品中所含菌數校對，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液總，混勻，過濾，用適量的沖洗液沖洗濾膜。  測定需氧菌總數，轉移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上；

10、測定霉菌和酵母菌總數，轉移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，按規定條件培養、技術。每株試驗菌每種培養基至少制備1張濾膜。同法測定供試品對照組和菌液對照組菌數。  6、結果判斷  計數方法適用性試驗中，采用平皿法或薄膜過濾法，試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5-2范圍內。若各試驗驗菌的回收試驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數方法進行該供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數。若存在一株或多株試驗菌的回收達不到要求，應選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進行供試品檢查。 二  供試品的檢查

11、60; 1、檢驗量   即一次試驗所用的供試品量（g、ml或cm2）。一般隨機抽取不少于2個最小包裝的供試品，混合，取10g、10ml或100cm2進行檢驗。 2、供試品檢查  按計數方法適用性試驗確認的計數方法進行供試品中需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的測定。胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基用于測定需氧菌總數；沙氏葡萄糖瓊脂培養基用于測定霉菌和酵母菌總數。 2.1陰性對照試驗  以稀釋液代替供試液進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。若有菌生長應進行偏差調查。 2.2平皿法

12、0;  取規定量的供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備和菌數測定，每稀釋級每種培養基至少制備2個平板。 2.2.1培養和計數  胰酪大豆胨瓊脂培養基平板倒置于3035培養箱中培養35天。沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板倒置于2025培養箱中培養57天，觀察菌落生長情況，點計平板上生長的所有菌落數并報告。菌落蔓延成片的平板不宜計數。點計菌落數后計算各稀釋級供試液的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌落數。若同稀釋級兩個平板的菌落數平均值不小于15，則兩個平板的菌落數不能相差1倍或以上。 2.2.2菌數報告規則  &#

13、160;需氧菌總數宜選取平均菌落數小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數宜選取平均菌落數小于100cfu的稀釋級，作為菌數報告的依據。取最高平均菌落數，計算1g、1ml或10cm2供試品中所含微生物，取兩位有效數字報告。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均茵落數小于1時，以小于1乘以最低稀釋倍數報告菌數。 2.3薄膜過濾法   按計數方法適用性試驗確認的計數方法進行供試液制備。取相當于每張濾膜含1g、1ml或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數較多時，可取適宜稀釋級的供試液，照方法適用性試驗確認的方法加至適量稀

14、釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基或沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上培養。  2.4培養和計數   培養條件和計數方法同平皿法，每張濾膜上的菌落數應不超過100cfu。 2.5菌數報告規則  以相當于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數報告菌數；若濾膜上無菌落生長，以1報告菌數（每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2供試品），或1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。3、結果判斷3.1需氧菌總數是指胰酪大豆胨瓊脂培養基上生長的總菌落數（包括真菌菌落數）；霉菌和酵母菌總數是指沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的

15、總菌落數（包括細菌菌落數）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的細菌使霉菌和酵母菌的計數結果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養基或其他選擇性培養基（如玫瑰紅鈉培養基）進行霉菌和酵母菌總數測定。使用選擇性培養基時應進行培養基適用性檢查。 3.2各品種項下規定的微生物限度標準解釋如下：  101cfu：可接受的最大菌數為20； 102cfu：可接受的最大菌數為200；  103cfu：可接受的最大菌數為2000，以此類推。 3.3若供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的檢查結果均符合該品種項下的 規

16、定，判供試品符合規定；若其中任何一項不符合該品種項下的規定，判供試品不符合規定。  控制菌檢查法  l、簡述  控制菌檢查法是用于在規定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在某些特定微生物。本標準的控制菌為大腸埃希菌CMCC(B) 44102、銅綠假單胞菌 CMCC(B) 10104和金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26003  供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結果為準，不再復試。 供試液制備及實驗環境要求同“微生物計數法”。 2、培養基適用性檢查和控制菌檢查方法 &#

17、160;   適用性試驗  供試品控制菌檢查中所使用的培養基應進行適用性檢查。供試品的控制菌檢查方法應進行適用性驗證。 2.1菌種  試驗用菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0袋），并采用適宜的菌種保藏技術進行保藏。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )CMCC(B) 26003銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10104大腸埃希菌(Escherichia col

18、i) CMCC(B) 44102 )乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）CMCC(B) 50094 白色念珠菌（Candida albicans）CMCC(F) 98001 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC(B) 64941 2.2菌液制備    將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基上，3035培養1824h；將

19、白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基或沙氏葡萄糖液體培養基中，2025培養23天； 將生孢梭菌接種于梭菌增菌培養基中置厭氧條件下3035培養2448h，或接種于硫乙醇酸鹽流體培養基中3035培養1824h。上述培養物用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。  菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2-8，可在24小時內使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，孢子懸液保存在2-8，在驗證過的貯存期內使用。 2.3陰性對照  為確認試驗條件是否符合要求，應進行對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長

20、。  2.4培養基適用性檢查  控制菌檢查用的培養基應進行培養基適用性檢查。檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示特性的檢查。各培養基的檢查項目及所用菌株。2.4.1液體培養基促生長能力檢查  分別接種不大于100cfu的的試驗菌株與被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不大于規定的最短培養時間下培養，與對照培養基比較，被檢培養基試驗菌應生長良好。  2.4.2固體培養基促生長能力檢查   用涂布法分別接種不大于100cfu的試驗菌株與被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定

21、的培養溫度及不大于規定的最短培養時間下培養，被檢培養基與對照培養基上生長的菌落大小、形態應一致。 2.4.3培養基抑制能力檢查    接種不少于100cfu的試驗菌株與被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不大于規定的最短培養時間下培養，試驗菌應不得生長。  2.4.4培養基指示特性的檢查   用涂布法分別接種不大于100cfu的試驗菌株與被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不大于規定的最短培養時間下培養，被檢培養基上試驗菌生長的菌落大小、形態特征、指示劑能力

22、等英語對照培養基一致。 2.5控制菌檢查方法適用性檢查  2.5.1供試液制備：按“供試品檢查”中規定的方法制備供試液。 2.5.2試驗菌  根據各品種項下微生物限度標準中規定的檢查控制菌選擇相應的試驗菌株。確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法是，采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。  適用性檢查   按控制菌檢查法取規定量供試液及不大于100cfu的試驗菌接入規定的培養基中，采用薄膜過濾法是取規定量供試液，過濾沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌，過濾后注入規定的培養基或取出濾膜接入規定的培養基中。依相應控制菌

23、檢查方法，在規定的溫度和最短培養時間下培養，應能檢出所加試驗菌相應的反應特征。  2.5.4結果判斷    上述試驗若檢出試驗菌，按此供試液之被罰和控制菌檢查方法進行供試品檢查；若未檢出試驗菌，營銷處供試品中的抑菌活性（中國藥典2015年版四部通則1105中抗菌活性的去除或滅活），并重新進行方法適用性試驗。  若經過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受抑制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。  3、供試品檢查    供試

24、品的控制菌檢查應經方法適用性試驗確認的方法進行。3.1陽性對照   陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加入量應不大于100cfu，陽性對照應檢出相應的控制菌。  3.2陰性對照    以稀釋劑代替供試液照相應控制菌檢查法檢查，陰性對照應無菌生長。 3.3大腸埃希菌（Escherichia coli）  3.3.1供試液制備和增菌培養    取供試品，照“微生物計數法”制成1:10的供試液，取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種于適宜

25、體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，3035培養1824h。 3.3.2選擇和分離培養    取上述培養物1ml接種至100ml麥康凱液體培養基中，4244培養2448h。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，3035培養1872h。  3.3.3結果判斷    若麥康凱瓊脂培養基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。 

26、; 3.4銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）  3.4.1供試液制備和增菌培養    取供試品，照“微生物計數法”制成1:10的供試液，取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種于適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，3035培養1824h。 3.4.2選擇和分離培養    取上述培養物1ml接種至溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養基平板上，3035培養1872h。取上述平板上生長的菌落進行氧化酶試驗，或采用其他適宜方法進一步鑒定。  3.4.3氧化酶試驗    將潔凈的濾紙片置于平皿內，用無菌玻璃棒取上述平板上生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1%鹽酸N,N