1、引物設計軟件oligo應用圖解在專門的引物設計軟件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分復雜，但初學者容易被其復雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0的初始界面是兩個圖：Tm圖和G圖；Oligo 6.0的界面更復雜，出現三個圖，加了個Frq圖。“Oligo”的功能比“Premier”還要單一，就是引物設計。但它的引物分析功能如此強大以至于能風靡全世界。oligo的下載和安裝我就不多說了，打開oligo相信也無需多講。打開oligo的頁面如下：單擊file菜單再點open或點擊“打開”快捷圖標或者用快捷鍵“CTrlO”可打開下面的窗口：在打開的OPEN窗口內選擇FreqSeq再點“打開”：選擇

2、drosfr或者其它一個文件點擊“打開”：出現以下窗口，點擊“window”再點擊“Tile”：出現以下窗口，圖中顯示的三個指標分別為Tm、G和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，為鄰近6至7個堿基組成的亞單位在一個指定數據庫文件中的出現頻率。該頻率高則可增加錯誤引發的可能性。因為分析要涉及多個指標，起動窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tile方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個指標，如Frq，這樣界面的結構同于Oligo 5.0，只是顯示更清楚了：G值反映了序列與模板的結合強度，最好引物的G值在5'端和中間值比較高，而在3'端相對低（如圖）。T

3、m值曲線以選取72附近為佳，5'到3'的下降形狀也有利于引物引發聚合反應。Frq曲線為“Oligo 6”新引進的一個指標，揭示了序列片段存在的重復機率大小。選取引物時，宜選用3'端Frq值相對較低的片段：再點擊Search再點“Fo'r Primers and probes”或使用快捷鍵F3： 出現以下窗口，點“OK”就OK了。當然你也可以點擊“Prameters”和“Search Range”選擇你要的參數和你上下游引物的位置及你擴增產物的長度：出現Search Status窗口，點“OK”： 出現Primer pairs窗口，#代表引物對的編號，依

4、次為引物對所處的位置、產物的長度、最適合的退火溫度、和GC的百分含量：點擊任一行出現“PCR”窗口，告知你擴增片斷的位置，最合適的退火溫度等等信息：關掉“PCR窗口”和“primer Pairs窗口”回到原來的窗口你就能看到你引物的序列和位置，圖中手型鼠標所指即為引物序列：至此引物設計已經完成，你可以用“Analyse”菜單分析你的引物：有無引物二聚體、發卡結構等等：當上下游引物全選好以后，需要對引物進行評價并根據評價對引物進行修改。首先檢查引物二聚體尤其是3端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。

5、二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測（非克隆）性PCR，對引物位置、產物大小要求較低，因而應盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項檢查是發夾結構（hairpin）；與二聚體相同，發夾結構的能值越低越好。一般來說，這兩項結構的能值以不超過4.5為好。當然，在設計克隆目的的PCR引物時，引物兩端一般都添加酶切位點，必然存在發夾結構，而且能值不會太低。這種PCR需要通過靈活調控退火溫度以達到最好效果，對引物的發夾結構的檢測就不應要求太高。第三項檢查為GC含量，以45-55為宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導致引物的GC含量不能被控制在上述范圍內，這時應盡量使上下游引物的G

6、C含量以及Tm值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。好了，oligo使用的簡單介紹到此結束。 在引物設計完之后可以使用軟件自帶的分析功能，操作如下：點擊“File”菜單中的“New Sequence”命令；在窗口中輸入上游引物；如果該引物的首位置不是1的話，可以在“Edit”窗口中輸入新的5端位置數字，如20；點擊Accept/Discard菜單的Accept命令；如果引物序列長度不同于當前的引物的話，可以從“Change”菜單中改變當前的引物長度；選取當前序列為上游引物（點擊“upper”按鈕）；從Edit菜單中選取“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗口中輸入下游引物的序

7、列；在Edit窗口的上角處，輸入相應的5位置；選取“Accept and Quit”命令；如果想讓程序給出最佳退火溫度，在此時的對話框中輸入PCR產物的長度以及GC含量所占百分比，一般哺乳動物的cDNA序列中GC大約占44。點擊OK就可以在“Analyze”菜單中完成各種分析了。關于引物的評價有幾點：duplex formation：這是評價引物二聚體形成的，包括自身形成二聚體和引物間二聚體，主要是看引物3端有無配對堿基(最好沒有)。其中的current oligo是當你對引物進行了編輯（如加入酶切位點）時，對原始引物進行的分析。（下同）形成的二聚體要看能值G(得它不會輸入啊！)，能值越低越好

8、，最好不要超過4.5（下同）。hairpin formation：這是看引物自身能否形成發夾結構，主要也是看3端不要形成發夾結構。還要看形成發夾結構的能值，不超過4.5。如果引物中加入酶切位點，可能會有發夾結構且能值不會太低，這就需要靈活控制退火溫度了。composition and Tm：分析上下游引物的堿基組成，GC比和Tm值，原則我就不多說了。false priming site：如果模板不是基因組DNA，而是一個特定模板序列，需要進行錯配的分析，看你的引物（尤其3端）是否與特定模板的其他位點結合。一般錯配的引發效率以不超過100為好，但并不絕對，如果正確結合位點的引發效率為450以上，而有一個錯配的引發效率是120左右的，這個