1、一、實驗目的 1了解微核測試的原理和毒理遺傳學在實際生活與工作中的應用范圍及意義2學習蠶豆根尖的微核測試技術二、實驗原理 微核（micronucleus, 簡稱MCN），也叫衛星核，是真核類生物細胞中的一種異常結構，是染色體畸變在間期細胞中的一種表現形式。微核往往是各種理化因子，如輻射、化學藥劑對分裂細胞作用而產生的。在細胞間期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小應在主核1/3以下。微核的折光率及細胞化學反應性質和主核一樣，也具合成DNA的能力。一般認為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片產生的。有實驗證明，整條染色體或幾條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在分裂過程中行動滯后，

2、在分裂末期不能進入主核，便形成了主核之外的核塊。當子細胞進入下一次分裂間期時，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核。已經證實，微核率的大小是和作用因子的劑量或輻射累積效應呈正相關，這一點與染色體畸變的情況一樣。蠶豆根尖微(micronucleus，MCN)技術是一種檢測化學品對生物毒害的遺傳毒理學方法。不僅具有簡便、快速、重復性好和靈敏度高的優勢，而且其檢測結果與動物試驗結果具有很高的一致性。 亞硝酸鹽廣泛存在于自然環境(水體、土壤、植物)中，許多腌制食品中亦含有亞硝酸鹽。在胃酸等環境下亞硝酸鹽與食物中的仲胺、叔胺和酰胺或蛋白質分解產物等反應生成強致癌物N_亞硝胺。亞硝胺還能夠透過胎盤進入

3、胎兒體內，對胎兒有致畸作用。硝酸鹽和亞硝酸鹽作為化學物質的毒害性多有研究，但把蠶豆根尖細胞微核技術用于食品添加劑的安全評價和檢測其對生物體誘變效應的遺傳毒理性試驗卻未見報道。NaNO2對蠶豆根尖的微核效應，由此證明蠶豆可以作為快速、靈敏檢測食品中亞硝酸鹽遺傳毒性的供試材料。三、實驗材料蠶豆種子、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、培養皿、濾紙、NaNO2 蒸餾水卡納氏固定液（3甲醇：1冰醋酸）改良苯酚品紅溶液四、實驗過程1、被測試劑的配制與分組 用蒸餾水將NaN02配制成001、002、004、008 mmol/L 4種不同的濃度；另設蒸餾水做對照(CK)組。另設蒸餾水做對照(CK)組。最后對應分成5組。

4、2 、浸種、催芽選取籽粒飽滿、大小一致的蠶豆種子洗凈后，放入盛有蒸餾水的燒杯中，25下浸泡24 h 期間換水2次。待種子吸脹后，用紗布包裹置于培養皿中，在25恒溫生化培養箱中催芽24 h，至初生根長至2 cm左右。3、染毒選取發育良好，大小與根近似的蠶豆幼苗，將幼苗分別放入盛有不同濃度NaNO3和不同濃度NAN02溶液的培養皿中，染毒6 h。然后用蒸餾水清洗根尖35次，換人新鮮蒸餾水培養24 h。同時用蒸餾水設立空白對照組。4、 根尖細胞固定切取根尖1 cm，用新配的卡諾氏固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)固定24 h，固定材料可經95酒精和70酒精各處理05 h，然后放入70酒精中，在4冰箱中保

5、存(保存時間不超過2個月)。5、 解離從固定液中取出蠶豆根尖，用蒸餾水漂洗，再放到010 molL HC1中，在60 水浴中處理15 min，再用45的醋酸處理10 min，使根尖軟化。6、 染色和壓片取處理好的根尖用蒸餾水漂洗后，置于載玻片上，用吸水紙吸去多余的液體，用刀片將根尖的分生組織切下并切碎，加12滴改良的苯酚一堿性品紅染色20 min，采用十字壓片法制片。7、鏡檢及微核識別標準常規制片后，將玻片標本放在顯微鏡的低倍鏡下觀察，找到分生組織區細胞分散良好、核膨大、分裂相多的部分轉到高倍鏡下進行觀察。微核識別標準：（1）在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。（2）小核著色與主核相當或稍淺。（3）小核形態為圓形、橢圓形或不規則型。每一處理觀察3個根尖，每個根尖計數1000個細胞中的微核數并進行記錄。五、實驗數據的統計處理和污染程度劃分將實驗數據按一下步驟進行統計學分析處理：1計算各測試樣品（包括對照組）微核千分率（MCN）如果對照本底MCN為10以下，可采用如下標準進行分析以確定樣品的污染程度：MCN在10以下，表示基本沒有污染；MCN在1018區間，則表示有輕度污染；MCN大于30，表示有重度污染；2.也可以計算各測試樣品（包括對照組）污染指數污染指數PI=實測微核率/對照組微核率PI<1.5 無污染1.5&l