1、PPR蛋白模塊化識別單鏈RNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)PPR蛋白（Pentatricopeptide repeat）是廣泛分布于各類生物中的一大類蛋白家族。是一種序列特異性的RNA結(jié)合蛋白，涉及到RNA生命代謝活動的多個方面。PPR蛋白陸生開花植物的線粒體和葉綠體中的含量格外的豐富，它是以一種模塊化的方式識別單鏈的RNA（ssRNA）。擬南芥葉綠體中的的PPR10蛋白結(jié)合分別來自基因ATPI-ATPH和PSAJ-RPL33編碼的相像的RNA序列，分別被稱為ATPH和PSAJ。通過愛護靶標(biāo)RNA元件免受3和5核酸外切酶的作用，PPR10能識別相應(yīng)的信使RNA 3和5末端。盡管識別機制特點，但其識別機理及識別密

2、碼尚不明確有待于進一步的闡明。在這里我們報道了PPR10蛋白不結(jié)合RNA和結(jié)合RNA的分子晶體結(jié)構(gòu)，它們的辨別率分別是2.85艾米和 2.45艾米。在不結(jié)合RNA時，19個重復(fù)片段構(gòu)成一個右手“超螺線”螺旋。兩個PPR10蛋白的單體反平行排列，相互纏繞組成一個二聚體，已經(jīng)結(jié)合在目標(biāo)RNA（18個核苷酸的PSAJ）分子上，就呈現(xiàn)出相當(dāng)大的構(gòu)型的變化。PSAJ有六個核苷酸被PPR10蛋白的六個相應(yīng)的重復(fù)序列特異性的識別依據(jù)猜測的識別密碼。特異性的分子基礎(chǔ)和RNA的A,G,U堿基的分子識別被揭示了。PPR蛋白識別RNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的闡明為PPR蛋白潛在的生物技術(shù)上的應(yīng)用供應(yīng)了一個基礎(chǔ)，在RNA相關(guān)爭辯

3、領(lǐng)域。PPR蛋白涉及到RNA生命代謝活動的多個方面，例如RNA的轉(zhuǎn)錄、剪切、編輯、和降解，翻譯等過程。在植物中PPR蛋白的突變可能導(dǎo)致胚胎的致死性 ，一些 PPR蛋白扮演者雄性不用的修復(fù)者的角色。在人類當(dāng)中線粒體PPR蛋白LRPPRC的突變是與加拿大法語社區(qū)的人的Leigh syndrome相關(guān)的，這種病的特征是復(fù)合體IV的缺陷。PPR蛋白包含2-30個串聯(lián)的重復(fù)片段，每個重復(fù)包含35個氨基酸，這35個氨基酸組成一個螺旋發(fā)卡結(jié)構(gòu)。PPR蛋白分為兩個系列：P系列，它的每一個重復(fù)都含有35個氨基酸;PLS系列，每個重復(fù)含有3136個氨基酸不等和額外的碳末端。計算機和生物信息學(xué)的分析表明PPR蛋白是

4、以一種模塊化的方式識別RNA的，但是這種方式不同于RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合方式。由生物信息學(xué)和生物化學(xué)的分析而推想的PPR蛋白識別RNA的識別密碼有待于晶體結(jié)構(gòu)的確認(rèn)。為了闡明PPR蛋白特異性識別RNA的機制，我們尋求確定結(jié)合了相應(yīng)的靶RNA的PPR蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。這種重組的擬南芥的葉綠體的PPR10蛋白，屬于P系列能特異性的結(jié)合17個核苷酸的ATPH和18個核苷酸的PSAJ(Extended Data Fig. 1a)。我們進行了一系列的努力來確定非結(jié)合RNA和結(jié)合RNA的PPR10的晶體結(jié)構(gòu)。包含有4重半胱氨酸突變(C256S/C279S/C430S/C449S)的非結(jié)合RNA的PPR

5、10蛋白片段（resident61-786)的晶體結(jié)構(gòu)被確定在2.85艾米的精度.PPR10蛋白形成一個兩圈的右手超螺旋的裝配結(jié)構(gòu),包含有19個PPR蛋白結(jié)構(gòu)域，它的氨基端是三個短的螺旋（NTD），碳末端是單一的螺旋（Fig.1a)。重復(fù)序列蛋白的端部結(jié)構(gòu)域是與配體的特異性結(jié)合相關(guān)的例如;TPR和TALE。PPR10蛋白的額外結(jié)構(gòu)域的功能有待于確定。每一個PPR蛋白結(jié)構(gòu)域的35個氨基酸組成一個螺旋發(fā)卡結(jié)構(gòu)。每個螺旋包含四圈，伴隨有一個5個氨基酸的loop結(jié)構(gòu)相連（Fig.1b)。這兩個螺旋，分別被命名為helix a和helix b,這兩個螺旋有一個兩個氨基酸的turn相連，每個重復(fù)的heli

6、x a和helix b分別構(gòu)成這個超螺旋組裝結(jié)構(gòu)的內(nèi)層和外層（Fig.1a)。在晶體結(jié)構(gòu)中PPR10的單個分子是非對稱的結(jié)構(gòu)，然而兩個非對稱的PPR10蛋白相互纏繞組成一個反平行的模式。一個分子的N端和另一個分子的C端相互靠近。然而這個橢圓體的極性軸的長度140艾米，徑長70艾米。在PPR10蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，我們定義在PPR motif的helix的第一個氨基酸殘基為開頭氨基酸(Fig.1bandExtendedData Fig. 1b)。相比于以前所定義的邊界范圍，這種定義開頭氨基酸的方法導(dǎo)致PPR motif一個殘基的前移或后移(Extended Data Fig. 1c)?；谶@種新的

7、PPR motif的邊界定義，所猜測的打算RNA結(jié)合特異性的殘基都在結(jié)構(gòu)上包含在一個起作用的motif上。我們期望這種基于結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的PPR motif邊界劃分將來能夠簡化對PPR蛋白的描述。經(jīng)受了很多的不成功的PPR10-ATPH結(jié)晶試驗后，我們最終確定了在結(jié)合有18個核苷酸的PSAJRNA的PPR10（risidues37-786,C256S/C279S/C430S/C449S）的晶體結(jié)構(gòu),辨別率為2.45艾米(Extended Data Table1).在晶體結(jié)構(gòu)中在每一個非對稱的單元中，都是一個反平行的PPR10二聚體。通過分析結(jié)合有PASJ的PPR10的超速離心沉降平衡平衡試驗，試驗支

8、持在毫摩爾的濃度下PPR10蛋白為二聚體存在的性質(zhì)（Extend Date Fig.2）.PPR10原體可以疊加為一個平角方差為1.3艾米的629個碳原子的一個蛋白結(jié)構(gòu)圖（Extend Date Fig2）。二聚體的整體外觀變成了一個空心的圓筒狀的管狀結(jié)構(gòu)（Fig.2a）,PPR10蛋白原體的N-末端和C-末端部分被壓進空心圓筒的中間，這導(dǎo)致了管狀結(jié)構(gòu)的軸向長度削減了20艾米的長度（Fig.2b）.PPR10蛋白的很多氨基酸填充在一張電子密度圖中，電子密度圖表明RNA堿基在圓柱形管的兩端是清楚可見的。兩個被結(jié)合的RNA元件的18和14個核苷酸的電子密度分布圖是由Br的特別信號來確定的。這種信號

9、時從結(jié)合有Br標(biāo)記的RNA寡核苷酸的PPR10蛋白的晶體結(jié)構(gòu)收集得到的。ssRNA的5端和3端部分分別由一個PPR10蛋白體的N末端重復(fù)部分和另一個PPR10蛋白原體的C末端特異性的結(jié)合。通過對比分析得知ssRNA的中間部分，包括U5和A11兩個核苷酸不與PPR10蛋白表現(xiàn)出相互協(xié)調(diào)作用的現(xiàn)象。PPR10有19個重復(fù)部分，PSAJRNA包含有18個核苷酸。PSAJRNA的特異性識別開頭于repeat3這是與在生物信息學(xué)分析上的猜測相全都的（Fig.3a）。在每個PSAJRNA的5末端的前四個核苷酸（5 -GUAU-3 ）中的每一個堿基都被4個氨基酸所包圍，這包括兩個相鄰的重復(fù)片段的其次位堿基和

10、分別來自這兩個相應(yīng)的氨基酸片段的第五位和第35個殘基，除了這種堿基識別，所結(jié)合的PSAJRNA的磷酸骨架和核糖基團，也可以與帶電荷的或極性的氨基酸相互協(xié)調(diào)作用（Extend Date Fig.5c）。在每一個重復(fù)部分的位于第5位的極性氨基酸對RNA堿基的特異性結(jié)合表現(xiàn)出格外重要的打算性作用，分別位于repeat3-6的Thr 178,Asn 213, Ser 249 and Asn 284分別通過氫鍵相互作用特異性的識別堿基G1,U2, A3 and U4。第5位氨基酸殘基的重要性是通過突變分析試驗而得到的，在repeats 4(N213A), 5 (S249L) or 6 (N284A)的第

11、5位殘基中的任何一個的突變都會結(jié)合RNA特性的消逝。相比較repeats7, 8, 10, 11 和 13的第5位殘基的替換，這些殘基是在結(jié)構(gòu)上不涉及到RNA特異性結(jié)合的殘基，所以對于PSAJ大的結(jié)合顯示出很小或沒有影響（Extend Date Fig.6）。氫鍵都是受到外環(huán)境的護壁遮掩。PPR10蛋白repeats3-7的其次位上的5個氨基酸殘基主要通過范德華相互作用夾持著4個堿基(Fig.3a).例如，G1堿基由Arg 175/Val 210，這兩個氨基酸分別位于repeat3和repeat4。同樣U2,A3，U4分別由Val 210/Phe 246, Phe 246/Val 281 an

12、d Val 281/Val 316夾持著。第35位的殘基也位于上述的殘基的四周位置，這有可能是水分子介導(dǎo)極性殘基與堿基之間的氫鍵，盡管在晶體結(jié)構(gòu)中看不見。值得重要一提的是Asp244和Asp314，這兩個氨基酸分別是repeat3和6的第35位氨基酸。Asp244和Asp314分別通過氫鍵結(jié)合在Asn213和Asn284上，這兩個氨基酸分別為相應(yīng)的repeats的第5位上的氨基酸，這種相互作用有助于穩(wěn)定PPR10的堿基識別構(gòu)想(Fig. 3b and Extended Data Fig. 6d)。由另一個PPR10原體的C末端的重復(fù)序列對PSAJRNA的3末端的識別沒有表現(xiàn)出明顯的模塊化的模式，除了U15和U16兩個，這兩個堿基由repeat16和repeat17來發(fā)生相互協(xié)調(diào)作用，依據(jù)上述的識別U2和U4的模式進行的。堿基A11和堿基C18是以一種非模塊識別的方式發(fā)生相互協(xié)調(diào)作用