1、2010年6月第3期5659甘 肅 農 業 大 學 學 報JO U RN AL O F G AN SU A GR ICU L T U RA L U N IV ERSIT Y 第45卷雙月刊Chi 和Bar 基因雙價植物表達載體的構建及轉基因煙草的初步檢測吳文俊, 賈小霞, 張金文, 王漢寧(甘肅農業大學農學院, 甘肅蘭州 730070摘要:構建了單子葉植物雙價表達載體pBI121 U bi Bar/Chi, 其中含有木霉幾丁質酶基因Chi 和抗除草劑B ar 基因, 均由玉米U bi 啟動子驅動. 以煙草無菌苗葉片為受體, 用農桿菌介導法將目的基因轉入煙草中; 以Bar 基因作為選擇標記, P

2、 PT 為選擇劑進行篩選, 獲得了一定數量的轉基因植株. 結果表明:經PCR 分析, 初步確定目的基因已經整合到煙草基因組中.關鍵詞:幾丁質酶基因; 抗除草劑基因; 載體構建; 煙草; 轉化中圖分類號:Q 812 文獻標識碼:A 文章編號:1003 4315(2010 03 0056 04Construction of plant ex pression vector containing Chi andBar genes and introduction them into tobaccoWU Wen jun, JIA Xiao x ia, ZH AN G Jin w en, WAN G H

3、 an ning(Co llege o f Ag ro no my, Gansu A g ricultur al U niv ersity , L anzhou 730070, ChinaAbstract:M ono coty ledon plant biv alent ex pression v ector w as constr ucted as pBI121 U bi Bar/Chi w hich included T r ichoder ma chitinase gene Chi and resistant herbicide B ar g ene that w ere star te

4、d by Ubi pro moter of m aize. T he target genes w er e transfer red directly to tobacco by A grobacter ium mediated meth o d, and the receptor w as leaf of tobaco aseptic seedling. Some tr ans genetic plants w ere obtained by selec ting w ith the PPT as selecto r, and Bar g ene w as selecting marker

5、. The targ et g enes had been integ rated to to bacco geno me prelim inarily thr ough PCR analy sis.Key words:chitinase g ene; herbicide resistance gene; vector construction; tobacco; transfo rmation 長期以來, 真菌性病害1和雜草危害是造成農作物產量大幅度下降及品質變劣的主要原因, 嚴重影響著農業生產. 盡管育種工作者在抗病和抗除草劑育種方面做了大量工作, 但由于品種抗性單一、病原菌生理小種變異太

6、快, 使之很快喪失抗病能力, 而傳統育種方式存在周期長, 可利用的種質資源匱乏等問題2. 基因工程技術作為一種有效的育種手段, 在作物育種中的應用不但可以有目的地改良其不良性狀, 加速育種進程, 而且可使遺傳物質的交換突破物種間的界限, 拓寬抗性資源, 可以解決作物抗病育種中由于抗性資源匾乏所造成的抗性不強和難以持久的 瓶頸 問題. 1991年, Brog lie 等3首次將菜豆幾丁質酶基因在CaMV 35S 啟動子的驅動下, 通過農桿菌介導法將其轉人煙草和甘藍型油萊中, 結果發現, 轉基因植物的根、莖、葉中幾丁質酶表達量均大幅度提高, 且對立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani 的抗

7、性得到了明顯的提高; Saw ahel 等4也用電擊法將B ar 基因導入了玉米幼胚中, 獲得了抗除草劑玉作者簡介:吳文俊(1983 , 男, 碩士研究生, 研究方向為玉米育種. E mail:w uw enju n121163. com 通信作者:王漢寧, 男, 教授, 主要從事作物遺傳育種教學及科學研究工作. E mail:w an ghngsau. edu. cn 基金項目:國家科技支撐計劃課題(2007BAD52B08 . : :2009 09 06米材料. 因此, 將抗病特性與耐除草劑特性組合起來, 發展具有多種特性的作物育種新資源具有重要意義. 鑒于此, 本試驗將木霉幾丁質酶基因和

8、抗除草劑B ar 基因6構建在同一植物表達載體上, 并對基因及表達元件進行了設計和修飾, 利用根癌農桿菌介導法將其導入煙草, 獲得了轉基因植株, 以期為進一步轉化玉米、小麥等作物, 培育出兼抗真菌病及抗除草劑的作物種質資源提供理論依據.595&預變性5m in; 94&變性1m in; 65&退火1m in; 72&延伸2min; 循環30次; 72&繼續延伸10m in.1. 4 雙價植物表達載體的構建酶切、連接和重組質粒轉化大腸桿菌以及重組克隆的篩選均按分子克隆實驗指南(操作7. 1. 5 雙價基因表達載體轉化煙草雙價基因表達載體轉化煙草采用葉盤法8

9、. 1. 6 轉基因煙草植株的PCR 鑒定用CT AB 法提取轉基因煙草基因組DNA 以1. 5 L 總DNA 為模板進行PCR 擴增.91 材料與方法1. 1 植物材料煙草品種! CV87由甘肅農業大學農學院實驗室保存, 取其無菌苗葉片為轉化外植體. 1. 2 菌株和質粒大腸桿菌DH 5 , 質粒pEG Chi(含幾丁質酶基因 , pBI121, 農桿菌EH A105均為本實驗室保存; 質粒pH Ac25(含有Bar 基因 由南京農業大學陳佩度教授饋贈. 1. 3 酶與試劑限制性內切酶, T 4DNA 連接酶, Taq 酶, CI A P 酶, 蛋白酶Q 等均為大連寶生物(TaKaRa 公司

10、產品; 核酸分子量標準為北京天為時代公司產品; LB 培養基所用藥品T ry ptone 、Yeast Ex tract 、Sodium Chlo ride 、Ag ar 以及除草劑PPT 等均購于上海Sango n 公司; DNA 回收試劑盒購于北京博大泰克公司.1. 4 PCR 引物及反應體系NOS 終止子引物:上游引物N 1:5# Sma ,2 結果與分析2. 1 雙價植物表達載體的構建以質粒pEG Chi 為模板, 用高保真酶, 以引物C 1和引物C 2進行PCR 擴增, 得到1275bp 的Chi 基因, 連接到T 載體上得到T Chi. 以pBI121為模板, 用引物N 1和N 2

11、進行PCR 擴增得到N OS 基因, 連接到T 載體上得到T NOS. 然后用S ma 和Sac 分別酶切T N OS 和pAH C25, 將切下的N OS 終止子片段和載體片段連接得到pAH C25 N os. 用Sma 和Sp e 雙酶切pAH C25 Nos 和T Chi, 連接酶切后的目的小片段和載體大片段得到中間載體pAH C25 Chi. 用E co R 和Bam H 雙酶切pBI121和pAH C25分別回收載體大片段和868bp 目的片段(包括B ar 基因和NOS 終止子 , 兩者連接得到重組質粒pBI121 Bar. 用Bam H 和H ind%雙酶切pBI121 Ba 和

12、H ind %Bam H %pAH C25, 分別回收載體大片段和包括U bi 啟動子的目的小片段, 兩者連接得到重組質粒pBI121 U bi Bar. 用H ind %單酶切質粒pBI121 U bi Bar 開環, 并用CI AP 酶進行去磷酸化處理, 以防止載體自連. 將回收得到的完整Chi 基因表達盒與開環的pBI121 U bi Bar 采用T 4DNA 連接酶進行連接, 最終得到雙價植物表達載體pBI121 U bi Bar/Chi (圖1.2. 2 構建過程中各重組質粒的鑒定2. 2. 1 Chi 基因的PCR 擴增 以pEG Chi 質粒為模板, 用引物C 1和C 2擴增出大

13、小為1275bp 的Eco O65GAAT TT CCCCGATCGT 3#; 下游引物N 2:5# GCGGA GCT C Sac Bam H H indSp e GAAT TCCCGAT CTAGT AACA 3#; 擴增反應條件:95&預變性5min; 94&變性1min; 65&退火1min; 72&延伸2min; 循環30次; 72&繼續延伸10min.Chi 基因引物:上游引物C 1:5# NcoSmaEco O65ATGT T Bam H GGGT T TCCTCGGAAA ATCC 3#; 下游引物C 2:5# Hind %GTT GA

14、G3: 圖1 載體pBI121 Ubi Bar/Chi 結構圖Fig. 1 Str ucture o f plasmid pBI121 U bi Bar/ Chi注:M. 核酸標準分子量; 1. PCR 產物.圖2 Chi 基因的PCR 擴增F ig. 2 A mplification o f chit inase g ene by P CR注:M. 核酸標準分子量; 1. pBI121 Ubi Bar 雙酶切產物.2. 2. 2 重組質粒pBI121 35S Bar 的酶切鑒定 將pBI121 35S Bar 質粒進行Bam H 、E co R 雙酶切鑒定, 結果酶切產生1條約800bp 大

15、小的片段, 與預期片段大小相符(圖3 .圖4 重組質粒pBI121 Ubi Bar 的酶切鑒定Fig. 4 Identif ication of pBI121 35S Bar by restr ictionenzymes digestio n2. 2. 4 重組質粒pAH C25 NOS 的PCR 擴增及酶切鑒定 用S ma 和S p e 雙切重組質粒pAH C 25 Nos, 經1%瓊脂糖凝膠電泳, 觀察到大小約為300bp 的特異帶, 與PCR 結果一致, 大小與預期的相符(圖5 , 說明重組質粒pAH C25 N os 已成功構建 .注:M. 核酸標準分子量; 1. pBI121 35S

16、 Bar 雙酶切產物.圖3 重組質粒pBI121 35S Bar 的酶切鑒定F ig. 3 Ident ificatio n o f pBI121 35S Bar by r est rictionenzy mes dig estion2. 2. 3 重組質粒pBI121 U bi Bar 的酶切鑒定 將pBI121 Ubi Bar 質粒進行Bam H 、H ind %雙酶切鑒定, 結果酶切產生1條約2000bp 大小的片段, 與預期片段大小相符(圖4 , 表明植物表達載體pBI121已改造成功 .注:M. 核酸標準分子量; 1. pAH C25 NOS 雙酶切產物; 2. PCR 產物.圖5

17、pAHC25 NOS 的PCR 擴增及酶切鑒定Fig. 5 Identificatio n o f pA H C25 N O S by restr iction2. 2. 5 重組質粒pAH C25 Chi 的PCR 擴增及酶切鑒定 用S ma 和S p e 雙酶切重組質粒pAH C 25 Chi, 經1%瓊脂糖凝膠電泳, 觀察到大小約為1000bp 的特異帶, 與PCR 結果一致, 大小與預期的相符(圖6 , 說明重組質粒pAH C25 Chi 已成功構建 .2. 3 雙價植物表達載體導入煙草及轉基因煙草的PC R 檢測將雙價載體用凍融法轉入根癌農桿菌EH A105, 葉盤法轉化煙草, 用5

18、mg L -1PPT (除草劑 篩選共獲得再生煙草植株60株. 取60株轉pBI121 U bi Bar/Chi 基因煙草植株葉片基因組DNA 進行Chi 基因的PCR 檢測, 有56株呈現陽性, 初步證明Chi 和B ar 基因已經整合進煙草基因組中(圖8.注:M . 核酸標準分子量; 1 3, 5 9. 轉基因植株; 4. 陰性注:M. 核酸標準分子量; 1. PCR 產物; 2. pAHC25Ch i 雙酶切產物.對照(未轉基因植株 .圖8 轉基因煙草PCR 分析F ig. 8 P CR analysis o f transgenic tobacco plants圖6 重組質粒pA HC

19、 25 Chi 的PCR 擴增及酶切鑒定Fig. 6 Ident ificatio n o f pA H C25 Chi by restrict ionenzy mes dig estion and P CR test3 討論與結論病害和草害是制約農業生產的一個重要的限制性因素, 因此, 病害和草害的研究和防治一直是一個重要的課題, 利用現代生物技術尋找廣譜而有效的抗病和抗除草劑的轉基因組合是切實可行的. 近年來, 除草劑抗性基因中研究應用較多的是B ar 基因, 它的表達產物可以提供對草丁膦(PPT 類除草劑的抗性, 用含相應有效成分的除草劑進行篩選可以收到較為明顯的效果, 所以抗除草劑基因

20、既可作為目的基因, 又可作為篩選基因.本試驗構建的植物表達載體是采用了已證明在轉基因玉米、水稻、小麥中具有較高的活性的Ubi 啟動子, Chi 基因已被證明對立枯絲核菌具有良好的抗性, 所以, 實驗中所構建的帶有Chi 和Bar 基因的雙價植物表達載體pBI121 Ubi Bar/Chi, 既針對了真菌性病害, 又可以降低在農業生產中除草所費的大量人力和財力, 并且已經進行了轉煙草實驗, 獲得了陽性植株, 檢測陽性率高達90%, 因而為該實用載體的進一步廣泛應用打下了基礎, 希望借此獲得抗病和抗除草劑的轉基因植物材料.頁2. 2. 6 重組質粒pBI121 Ubi Bar /Chi 的PCR

21、擴增及酶切鑒定 用Sm a 和Sp e 雙切重組質粒pBI121 Ubi Bar/Chi, 經1%瓊脂糖凝膠電泳, 觀察到大小約為1200bp 的特異帶, 與PCR 結果一致, 大小與預期的相符(圖7 , 說明載體pBI121 Ubi Bar/Chi 已成功構建 .注:M. 核酸標準分子量; 1. pBI121 U bi Bar/Chi雙酶切產物; 2. PCR 產物.圖7 重組質粒pBI121 Ubi Bar/Chi 的酶切鑒定Fig. 7 Ident ificatio n o f pBI121 U bi Bar by restrict ion Land Reclamatio n M ini

22、sterial Decree, 20015 T suneda A , Skor opad W P , T ewar i J P. M ode of par asitism of A lter nar ia br assicae by N ectr ia inventa J. Phy topatholog y, 1976, 66:1056 10646 Rajan P P. A ppr oaches tow ar ds t he integr ated diseasemanagement o f Phy topht ho ra infectio n o f black pepper (P ip e

23、r nig r um L. J. A bst of M Sc. and Ph D D is ser tatio ns on Spice Cro ps, T echnica l Bull, 2005, (8 :63 647 戴芳瀾. 中國真菌總匯M , 北京:科學出版社, 19798 Zar e R, G ams W , Culham A. A r evisio n o f V er ticilliumsect. p r ostr ata I. Phylog enetic studies using IT S se quences J. N ov a Hedwigia, 2000, 71:465

24、 4809 Sung G H, Spatafor a J W , Zare R, et al. A rev isio n ofV erticillium sect. p r ostr ata . II. Phy log enet ic analy ses o f SSU and LSU nuclear r DN A sequences fr om anamor phs and teleo mor phs of the Clav icipitaceaeJ.N o va H edw ig ia, 2001, 72:311 32810 G ams W , Z are R. A rev ision o

25、 f V er ticillium sect.p r ostr ata . III. Generic classificat ion J.No va H ed w ig ia, 2001, 72:329 33711 Zar e R, Gams W. A rev ision of Ver ticillium sectionp r os tr ata . IV. T he g ener a L ecanicillium and Simp li cillium J. N ov a Hedw ig ia, 2001, 73:1 5012 Zar e R , G ams W , Evans H C. A

26、 revision of Ver ticillium sectio n pro st rata. V. T he g enus Pochonia , w ith notes o n Ro tifer ophtho ra J. N ov a H edw ig ia, 2001, 73:51 8613 Zar e R, Gams W. A rev ision of Ver ticillium sectionp r os tr ata . V I T he genus H ap tocillium J. N ov a H edw ig ia, 2001, 73:271 292(責任編輯 李 辛(上接第59頁 參考文獻1 王代軍, 胡桂馨. 應用和改良禾草內生真菌的研究進展與現狀J. 甘肅農業大學學報, 1999, 34(3 :213 2182 吳永升, 莫偉健, 譚華, 等. 生物技術在玉米育種中的應用J. 廣西農業科學, 2006, 37(2 :104 1073 Brog lie K E, Chet I, Ho lliday M. T r ansg enic plant w ithenhanced r esist ance to the fun