1、不同濃度游離脂肪酸對大鼠系膜細胞外基質基因表達的影響 作者：魏明 盧永申 張俊峰 李盼盼【摘要】 目的 探討不同濃度游離脂肪酸（FFAs）對大鼠系膜細胞外基質基因表達及合成分泌的影響。方法 以體外培養大鼠系膜細胞為基礎，采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）技術檢測型膠原（Col）、纖維連接蛋白（FN）、轉化生長因子（TGF1）mRNA的表達；采用酶聯免疫吸附ELISA）試驗法檢測培養系膜細胞上清液Col、FN的水平。 結果 25、100、400 mol/L 軟脂酸（PA）刺激組Col、FN、TGF1 mRNA的表達分別為（0.99±0.18、1.24±0.16、1.38&#

2、177;0.21）、（0.91±0.13、1.14±0.12、1.28±0.11）和（1.21±0.09、1.43±0.07、1.54±0.06），與0 mol/L對照組比較（0.61±0.17、0.62±0.08、0.81±0.10），差異有統計學意義（均P0.01）；25、100、400 mol/L PA刺激組Col、FN的分泌分別為（59.97±6.48、67.24±6.86、74.38±7.21）ng/ml和（100.91±7.13、135.04±

3、8.12、154.18±9.11）ng/ml，與0 mol/L對照組比較（48.84±6.17、88.68±8.08）ng/ml，差異有統計學意義（均P0.01）。結論 FFAs具有促進系膜細胞外基質基因表達和分泌的作用，可能在腎小球硬化病理過程中發揮著重要作用。 【關鍵詞】 脂肪酸；型膠原；纖維連接蛋白；轉化生長因子分別采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）技術和酶聯免疫吸附（ELISA）試驗法對系膜細胞外基質型膠原(Col)、纖維連接蛋白(FN)、轉化生長因子1（TGF1）mRNA表達和體外培養合成分泌水平進行檢測，旨在探討不同濃度游離脂肪酸（FFAs）對系膜細

4、胞外基質Col、FN、TGF1 mRNA表達的影響以及其在腎小球硬化發病機制中的作用。1 材料與方法1.1 材料RPMI1640培養基及新生小牛血清（FCS）為美國Gibco產品，軟脂酸（PA）及小牛血清蛋白（dBSA）為美國Sigma產品。1.2 細胞培養大鼠腎小球系膜（HBZY1）細胞購于鄭州大學生理教研室，用含10FCS、100 U/ml青霉素及100 g/ml鏈霉素的RPMI1640培養液制成單個細胞懸液，接種于100 ml培養瓶內。當HBZY1細胞長至80融合時，用0.25胰蛋白酶消化傳代，取第1114代HBZY1細胞用于實驗。37 5CO2 100%濕度條件下培養24 h,使細胞處

5、于對數生長期，換成0.5 FCS RPMI1640培養液培養24 h使細胞處于靜止期。1.3 實驗分組吸出孔內培養液，加入PA使終濃度分別為25、100、400 mol/L dBSA，實驗重復3次。1.4 RTPCR體系按上述方法分組給藥，HBZY1細胞繼續培養72 h，PBS沖洗3次，加入1 ml Trizol RNA提取液，提取細胞總RNA。根據A260/A280值計算總RNA濃度。Col、FN、TGF1 mRNA的引物序列見表1。引物由上海生物工程公司合成。在25 l 的反應體系中含引物各10 pmol/L，2.5l的10×buffer，1 mmol/L dNTP，1l Taq

6、酶，變性94 1 min，退火57 1 min，延伸72 1 min，35個循環，72延伸2 min。表1 Col、FN、TGF1 mRNA引物序列（略）1.5 PCR擴增產物電泳取擴增產物5 l加載樣緩沖液1 l，在含有0.5 g/ml 溴化乙啶的2瓊脂糖凝膠中電泳，標準物為DL2 000 Marker。通過法國紫外凝膠成像系統分析電泳帶灰度。1.6 ELISA法檢測培養上清液Col、FN含量將5×104/ml HBZY1細胞接種于24孔微量板中培養24 h，使細胞處于對數生長期，換成0.5FCS RPMI1640培養液培養24 h使細胞處于靜止期。加入軟脂酸1 ml使終濃度分別為

7、25、100、400 mol/L dBSA，繼續培養72 h，實驗重復3次。1.7 統計學處理數據以x±s表示。對于正態分布的變量應用單因素方差分析，偏相關分析用于在其他變量固定的條件下某兩個相關變量相關分析的檢驗；所有統計學處理均使用SPSS10.0軟件進行。2 結果2.1 不同濃度PA刺激對HBZY1細胞Col、FN、TGF1 mRNA表達的影響以25、100、400mol/L PA刺激后，Col、FN、TGF1 mRNA表達量均明顯升高，與0 mol/L對照組比較差異有統計學意義（P0.01）。Col、FN、TGF1 mRNA表達量間兩兩比較差異有統計學意義（均P0.05）。H

8、BZY1細胞Col、FN、TGF1 mRNA表達量呈濃度依賴性升高，見圖1和表2。表2 不同濃度 PA對HBZY1細胞Col、FN、TGF1 mRNA表達的影響(略)2.2 不同濃度 PA刺激對HBZY1細胞Col、FN分泌水平的影響以25、100、400 mol/L PA刺激后，Col、FN分泌水平均明顯升高，與0 mol/L對照組比較差異有統計學意義（P0.01）。Col、FN 分泌水平間比較差異有統計學意義（P0.05）。 PA 促進HBZY1細胞合成分泌Col、FN，并具有濃度依賴性。見表3。表3 不同濃度 PA對HBZY1細胞Col、FN分泌的影響(略)3 討論 細胞外基質（FN、C

9、ol、TGF1）是細胞生存的微環境，廣泛存在各種細胞表面，是構成基底膜的主要成分。在人體的發育、細胞分化與遷移、信號傳導等生理過程和炎癥損傷與修復、免疫應答以及腫瘤轉移病理過程中具有重要功能和作用1。長期以來，細胞一直是生物界研究疾病的重點。近年來，細胞外基質在疾病的發生中所起的作用越來越受到重視。FFAs與腎小管間質損傷密切相關，是慢性腎臟疾病的一個進展因素。Kamijo等2報道FFAs能導致腎小管間質損傷。在腎病綜合征不是由于白蛋白而是由于結合了FFAs的白蛋白引起了腎小管損傷3。Thomas等4通過大鼠模型研究發現，白蛋白結合FFAs組在巨噬細胞浸潤、細胞凋亡和皮質細胞增殖方面均比白蛋白

10、未結合組顯著。 本研究結果顯示，不同濃度 PA刺激HBZY1細胞后，Col、FN、TGF1 mRNA表達量均明顯升高，并呈濃度依賴性。提示PA能促進系膜細胞外基質基因的表達。同時還顯示HBZY1細胞合成分泌Col、FN水平也顯著增加，并呈濃度依賴性，表明PA能促進系膜細胞蛋白質的合成。提示FFAs可能是腎小球硬化的一個誘導因素。總之，在生理情況下腎小球內細胞外基質的合成和降解保持動態平衡，以維持正常的生理功能。當某些病理因素（糖尿病、腎病等）致FFAs增多，導致細胞外基質合成增加或降解減少，造成細胞外基質成分積聚，使細胞外基質的大量堆積引起腎小球硬化發生、發展。【參考文獻】 1 潘琳，李光偉，

11、郭艷茹，等.細胞外基質纖維連接蛋白和層黏連蛋白在糖尿病大鼠DR微血管病變表達的研究J.中華糖尿病雜志，2004；12（1）:568.2 Kamijo A，Sugaya T，Hikawa A,et al.Urinary fatty acid bound to albumin aggravate tubulointerstitial damageJ.Kindney Int，2002；62（12）:162837.3 Kamijo A，Sugaya T，Hikawa A,et al.Urinary fatty acid binging protein as a new clinical marker for the progression of chronic renal diseaseJ. Rinsho Byori，2003；51（2）：