1、人類全基因組SNP分型芯片檢測(cè)先天性智力低下患者1例曹爍 程寅龍 葉萃德染色體核型異常是兒童智力低下的最常見的病因，對(duì)智力低下的兒童進(jìn)行核型分析，可以明確診斷患兒的染色體。傳統(tǒng)的核型分析雖然是目前染色體異常檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但亦有其局限性。隨著人類基因組測(cè)序的完成以及分子遺傳學(xué)研究方法的進(jìn)步，對(duì)患者進(jìn)行分子核型的檢測(cè)已經(jīng)成為臨床遺傳學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)，是對(duì)傳統(tǒng)核型分析的有效補(bǔ)充，本研究擬采用核型分析以及人類全基因組SNP分型芯片檢測(cè)1例先天性智力低下患兒。1.對(duì)象和方法1.1研究對(duì)象 患兒，女，1歲，生長發(fā)育遲緩，智力水平低下，眼距寬，鼻梁低平，眼裂小，眼外側(cè)上斜，有內(nèi)毗贅皮，外耳小，硬腭窄小，頭圍小于

2、正常，骨齡落后于年齡；頭發(fā)細(xì)軟而較少；四肢短，關(guān)節(jié)過度彎曲，手指粗短，小指向內(nèi)彎曲。1.2 研究方法1.2.1 外周血染色體核型分析 (1)接種 取肝素抗凝的外周血0.5ml無菌接種于1640培養(yǎng)基中。 (2)培養(yǎng) 將接種后的標(biāo)本置于37。C中培養(yǎng)72小時(shí)。 (3)收獲 將培養(yǎng)物進(jìn)行低滲、預(yù)固定、固定、過夜、滴片、烤片。 (4)對(duì)染色體進(jìn)行G顯帶處理。 (5)顯微鏡下進(jìn)行核型分析 計(jì)數(shù)30個(gè)分裂相，分析5個(gè)分裂相。 (6)染色體輔助分析系統(tǒng)進(jìn)行資料儲(chǔ)存，打印報(bào)告。1.2.2 人類全基因組SNP分型芯片檢測(cè) 酚-氯仿的方法提取基因組DNA (1)取1ml左右外周血于EDTA抗凝管中

3、。 (2)加入20ul蛋白酶K，置于60水浴中2h。 (3)加入酚：氯仿：異戊醇(25:25:1) 300µl:300µl:12µl，置于離心機(jī)中12000 r/min離心10min。 (4)將上清置于另一Eppendorf管中，然后加入2倍體積的無水乙醇，置于室溫沉淀1min，12000r/min離心10min。 (5)棄上清，再加入1ml無水乙醇抽提一次，棄上清，控干Eppendorf管。 (6)加入100µl的TE緩沖液或蒸餾水溶解。測(cè)定DNA模板的濃度(1)以移液槍吸取樣品（12µl）滴加到檢測(cè)平臺(tái)上。 (2)放下取樣臂。

4、(3)獲可得樣品參吸光度和濃度。 (4)用干凈的吸水紙擦去上下檢測(cè)平臺(tái)上的樣品。 (5)A260/280在1.62.0之間，說明DNA純度合格，同時(shí)經(jīng)測(cè)定DNA濃度。 SNP微陣列檢測(cè) 采用Illumina HumanCytoSNP-12芯片對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)分3天進(jìn)行，流程如圖1(1)實(shí)驗(yàn)第1天：將標(biāo)本置于96深孔板中，按照Illumina公司提供的infinium HD試劑擴(kuò)增（擴(kuò)增1000倍），處理實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，處理完畢后將96深孔板置于Illumina 雜交爐中，37保溫?cái)U(kuò)增13h。（擴(kuò)增區(qū)與擴(kuò)增后區(qū)域應(yīng)該嚴(yán)格分開，防止污染）。(2)實(shí)驗(yàn)第2天：DNA片段化、沉淀、

5、重懸、雜交（雜交時(shí)間12小時(shí)左右，不應(yīng)超過24小時(shí)）。(3)實(shí)驗(yàn)第3天：芯片洗脫、真空干燥、上機(jī)掃描、分析結(jié)果。圖1 Illumina HumanCytoSNP-12實(shí)驗(yàn)的流程圖2. 結(jié)果2.1 外周血染色體核型分析 對(duì)患兒進(jìn)行染色體核型分析，核型為46,XX,-10,+?10，患兒10號(hào)染色體多出一條帶，經(jīng)分析無法確認(rèn)其來源。核型圖見圖2 圖2 患兒核型46,XX,-10,+?102.2 SNP微陣列檢測(cè) 對(duì)患兒進(jìn)行人類全基因組SNP分型芯片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)10號(hào)染色體多出的這條帶的來源為10q21.3-q23.31，一個(gè)23.7Mbp的重復(fù)片段，從而明確其來源。分子核型見圖3 圖3 分子核型46

6、,XX,dup(10)( q21.3-q23.31,23.7Mbp),10號(hào)染色體異常部分3. 討論染色體異常是患兒先天性智力低下的主要病因，對(duì)先天性智低患兒進(jìn)行染色體檢測(cè)可以明確診斷，為患兒的預(yù)后評(píng)估提供可靠的依據(jù)。染色體的檢測(cè)方法中G-顯帶的染色體核型分析技術(shù)是細(xì)胞遺傳學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，亦是目前普遍采用的方法，其能夠同時(shí)檢測(cè)出染色體數(shù)目的異常及大片段結(jié)構(gòu)的異常。其基本原理為人體外周血淋巴細(xì)胞從細(xì)胞分裂間期進(jìn)入分裂中期，經(jīng)秋水仙素處理后，使細(xì)胞分裂停止在有絲分裂的中期，用顯微鏡可以觀察到染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于能直觀地觀察到染色體的結(jié)構(gòu)與數(shù)目，對(duì)于大片段（10Mbp）的缺失與重復(fù)

7、提供可靠的依據(jù)。但此種方法也有不足之處，主要是操作繁瑣，需要手工操作，耗費(fèi)大量的人力，而且培養(yǎng)周期長，染色體的觀察需要由經(jīng)驗(yàn)豐富的研究人員完成，對(duì)于某些不明來源的區(qū)帶無法確診。基于微陣列的基因組拷貝數(shù)量分析是目前最先進(jìn)的臨床遺傳學(xué)檢測(cè)方法，該方法又被稱為CMA或分子核型，包含aCGH與SNP微陣列技術(shù)。與G-顯帶核型分析可以識(shí)別并檢測(cè)染色體的重排，包括基因組的獲得與丟失相比，CMA檢測(cè)也具有相似的功能，同時(shí)對(duì)基因組的不平衡即染色體微缺失或微重復(fù)的檢測(cè)具有較高的分辨率，該方法不需要培養(yǎng)，故已經(jīng)成為分子遺傳學(xué)檢測(cè)最具發(fā)展?jié)摿Φ姆椒āNP檢測(cè)方法的原理是：SNP是指基因組DNA中某一特定核苷酸位置

8、上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化,而且任何一種等位基因在群體中的頻率不小于1%。以SNP用作遺傳標(biāo)記進(jìn)行基于微陣列的基因組拷貝數(shù)量分析，可以檢測(cè)染色體的微缺失、微重復(fù)等，可以得到患者的分子核型。本研究患兒經(jīng)過外周血染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)其10號(hào)染色體多一條帶，但用傳統(tǒng)的方法無法確認(rèn)其來源，所以進(jìn)而采用SNP微陣列技術(shù)檢測(cè)其分子核型，發(fā)現(xiàn)這條帶是10號(hào)染色體q21.3-q23.31區(qū)域的自身重復(fù)，此位置有與智力低下相關(guān)的基因存在，從而找出患兒智低的遺傳學(xué)方面的原因，提示患兒預(yù)后不良，只能通過早期干預(yù)，開發(fā)患兒的智力水平。同時(shí)建議其父母進(jìn)行染色體核型分析，以進(jìn)一步研究患兒染色體異常的機(jī)制。參考文獻(xiàn)1. 曹娟,范琦慧,陳志央,等. 227例染色體病胎兒病例的回顧分析.中國優(yōu)生與遺傳雜志,2015,1:34-36.2.范永紅,王琳.589例產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的產(chǎn)前診斷.中國優(yōu)生與遺傳雜志,2015,2:63-64.3.Miller DT,Adam MP,Aradhya S,et al.Consensus statement: chromosomal micro- array is a first-ti