1、新生兒缺氧缺血性腦病動物模型的建立【關鍵詞】 新生兒 缺氧缺血性腦病 動物模型新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxicischemic encephalopathy, HIE）是指由于圍產期窒息缺氧導致腦的缺氧缺血性損傷，患兒生后出現一系列神經系統后遺癥的表現。如果不經過積極正規的治療，患兒的死亡率高，存活者常留下或輕或重的神經后遺癥。HIE不僅嚴重威脅著新生兒生命健康，并且是國內外傷殘兒童重要病因之一，給家庭和社會帶來了沉重的負擔1。在國內外圍產醫學界中，至今對HIE缺乏安全有效的治療方法，特別是對傳統常用藥物如苯巴比妥鈉、地塞米松及甘露醇等，國外嚴格的對照研究發現，這些藥物對腦損害及預后的改善

2、并不理想，這主要是因為新生兒大腦與成人大腦在發育和功能等方面存在有巨大的差異2，對成人安全有效的藥物并不一定適用于新生兒。由于近年來對HIE發病機制的研究取得很多進展，因此，根據發病機制去尋求改善腦損害的藥物一直是國內外圍產醫學領域的重要課題。HIE發病機制和合理用藥的實驗研究基于動物實驗，要力尋解決HIE治療難題的途徑，首先要涉及HIE模型的制備。長期以來，圍繞著如何建立一種適用有效的HIE動物模型的問題，國內外醫學工作者做了長期大量的研究工作。 1 模型動物的選擇 缺氧缺血造成的腦損傷在不成熟的大鼠、兔、綿羊及猴等實驗動物模型中得到證明，這些模型也已經提供了大量重要的信息，不僅闡明了組織損

3、傷的病理和生理機制，而且為各種特殊治療策略的有效性提供了有力的證據。因此，在動物實驗研究中，常以缺氧缺血性腦損傷新生動物作為研究對象。Yager 等3曾在2004年作過統計，在200多種新生兒HIE相關動物實驗中，大鼠應用最廣泛（29%），接著是豬（25%）和羊（20%）。在這些動物模型中，胚胎期或新生的恒河猴和未成熟的大鼠被研究應用得最廣泛，因為這兩種新生動物在神經解剖及生理復制等方面與人類最為接近，其中新生大鼠優勢更多，如容易獲取，母鼠孕期短、繁殖快，1窩可生815只，費用低，有利于實驗條件的控制，而新生豬、猴、羊等來源較困難，死亡率高，費用高。因此，長期以來，國內外醫學工作者常把新生大鼠

4、作為研究新生兒HIE的首選實驗動物。 2 模型動物年齡的選擇 用于新生兒HIE實驗的模型動物有很多，我們以應用最多的新生大鼠為例。不同年齡的大鼠其大腦發育程度是不一樣的，研究發現，新生7 d大鼠的中樞神經系統是不成熟的，其發育程度類似于孕3234周的人類胎兒或新生兒4，大腦皮層的神經分層完整，生發機制退化，白質也已有少量髓鞘形成，其能量代謝、神經遞質、血流動力學、蛋白質代謝以及免疫炎性改變等均能被很好地加以特征化5，其繼發能量衰竭及腦電圖類型與嚴重窒息新生兒的臨床發現相似，這對于評價神經保護藥物的短期和長期療效尤為重要。因此長期以來，研究者大多采用新生7 d的大鼠作為新生兒HIE模型動物。隨著

5、研究的深入，超低齡大鼠（如生后12 d大鼠）也被用于試驗中，并且揭示出極度不成熟大腦在損傷易感性上有重要的差異，這為新生兒HIE的研究開辟了一條新的途徑。和新生7 d大鼠相比，超低齡大鼠的腦損傷要求更長時間和更嚴重程度的缺氧，而隨之產生的同側腦皮質下白質損傷也更加嚴重，主要是少突膠質細胞的始祖細胞的死亡，這種神經細胞雖然是過渡性的，卻起著非常重要的作用，它的過早死亡也許能更好地解釋在許多早產兒中普遍存在的神經系統發育異常以及單一的腦白質損傷現象。 3 模型動物的誘導方法 建立動物模型的過程應該盡量與新生兒HIE發病過程相似，這樣才能更好地模擬新生兒HIE的發生發展。單純缺氧或單純缺血或缺氧伴缺

6、血是誘導缺氧缺血性腦損傷常用的方法，這些方法在某些研究細節上有著明顯的差別。長期以來，國內外采用的新生兒HIE動物模型的誘導方法主要有： 3.1 經典法 該法由Vannucci于1981年在Levine的成年大鼠缺氧缺血性腦損傷模型基礎上經過改進而建成，至今二十多年在全世界被廣泛應用。其具體操作方法如下：生后7 d大鼠麻醉后行左頸總動脈結扎術，術后恢復48 h后置于氧濃度為8%、環境溫度為37 的密閉容器內持續缺氧3.5 h。該法具有不少優點，譬如容易實施，在血流變化以及細胞代謝紊亂等方面與出生時窒息情況很相似，花費不多就能提供長時程的神經病理性損害及功能的評估，還能用大量的動物做出保護性試劑

7、的劑量反應性評價等。使用該方法，大腦損傷通常局限于頸總動脈結扎那一側的大腦半球，隨著缺氧持續時間的不同，出現選擇性神經元死亡和梗塞，在大腦皮質、海馬、紋狀體及丘腦都能看見組織損傷，皮質下及腦室周圍白質的損傷也能被觀察到6。這種模型已被證實在缺氧缺血性腦損傷對運動能力、行為、癲癇發作、大腦成熟過程及其他機制的短期和長期影響的研究上是非常有用的。最近，隨著大腦缺氧缺血分子生物改變的確定，該模型已被用于基因改變的未成年大鼠的特殊研究。 3.2 局部短暫腦缺血及再灌注法 該法由S. Renolleau等建立，多年來已由Sola等人多次改進7，基本操作如下：新生7 d大鼠麻醉后電凝左側大腦中動脈，再用夾

8、子夾閉左側頸總動脈1 h造成大腦局部缺血，1 h后去除夾子，使左頸總動脈再通，從而誘導再灌注形成。最近的研究表明，這類模型在腦缺血的不同時段其再灌注程度是不一樣的。在缺血后期，大量腦細胞內出現嚴重酸中毒及ATP完全消失的現象，缺血后腦皮質血流量很快下降到腦缺血前11%的水平。再灌注過程中，細胞內的ATP及pH值在3 h內都能恢復，頸動脈血流量也能恢復。該模型的誘導過程與新生兒HIE的發病過程相似811，主要用于研究暫時性缺血誘導的單純缺血（沒有缺氧）及再灌注后半胱氨酸天冬氨酸酶對新生鼠大腦的影響和半胱氨酸天冬氨酸酶抑制劑對新生兒HIE是否具有潛在治療作用。在臨床上，隨著新生兒重癥監護的加強，腦

9、的缺血再灌注損傷經常發生于新生兒HIE的搶救治療過程中，而該模型成功誘導新生7 d大鼠產生了腦缺血再灌注過程。此外，通過閉塞局部腦血管也能更好地界定腦梗塞范圍。 3.3 宮內缺氧缺血法 多年以來，在新生兒HIE研究中最大的不足就是對宮內缺氧缺血所致腦損傷不能進行準確真實的描述，而宮內缺氧缺血正是新生兒HIE重要病因之一。最近幾年，國內外醫學工作者正在逐步彌補這種不足，應用最多的宮內缺氧缺血模型有兩種：一種是誘導孕羊患上低氧血癥12；另一種是結扎孕羊臍帶13，從而造成胎羊宮內缺氧缺血性腦損傷。研究者應用這兩種模型，獲取了豐富的神經生理學相關資料，但這兩種模型仍然有很大缺陷：（1）孕羊體型大，價格

10、昂貴；（2）能確證受累胎羊腦損傷的可靠依據很少，從而不能對受累胎羊隨后的神經行為學后果進行測試。最近，一種新的模型極大的彌補了上述模型的不足，即用足月胎兔替代胎羊，這種新的模型能模擬急性胎盤供血不足所致的新生兒HIE，通過該法存活的新生兔明顯顯示出由于腦損傷所致的持久的肌張力過高和運動行為缺陷等。 同類的實驗模型還有： 腦室周圍白質軟化模型14以及可同時造成神經元丟失和腦室周圍白質軟化模型等15，研究者可根據不同的目的和需要酌情選擇適用的模型。 4 尚需解決的問題 在多年以來的HIE動物模型研究過程中，仍然存在著不少尚未解決的問題，譬如經典法模型就存在以下問題：第一，新生兒HIE患者全身各個系

11、統均遭受不同程度缺氧缺血打擊，而該模型只結扎一側頸總動脈，僅引起單側大腦病變，而不能使全腦及全身其他系統一同受損，因此不能造成臨床上嚴重窒息后經常引起的多器官損傷，也不易建立足月兒常見的旁矢狀竇區損傷和早產兒多見的腦室周圍白質軟化的損傷。由此看來，該模型病變分布與新生兒HIE并不完全一致。第二，在臨床上，缺氧窒息是新生兒HIE發病的核心，且大多源于胎兒宮內窘迫及新生兒窒息，缺氧往往同時伴有缺血的存在，兩者沒有截然分開。而該法是通過先結扎單側頸總動脈造成缺血，然后再通過持續吸入低濃度氧造成缺氧，從而將缺氧缺血兩個過程先后分開，這與臨床上不一致。第三，該法采用的是逐只麻醉后進行手術，如果要同時進行

12、大批量的模型研究就顯得力所不及，且麻醉和手術必然會增加各種人為、外界環境因素對模型動物損傷程度的影響，從而造成各模型動物在損傷程度上的不一致。第四，該法不能進行心血管監測和反復抽取血樣。此外，大鼠為平腦動物，不似人腦呈多腦回，大鼠腦損傷后也不像臨床上新生兒腦損傷的程度和類型常呈多樣化等。 其他模型也存在有很多不足。Yang等16做過統計，從1955年至2004年，在對新生兒HIE動物模型的研究中，其中關于缺氧缺血后對中樞神經系統影響的各種測試多在損傷后1 h內進行，只有39%的實驗在腦損傷24 h后對各種指標進行測試，大多數的研究都以急性的中樞神經系統代謝終點作為評估指標，而只有少量研究對臨床的神經學行為后果以及神經病理學作出評估。迄今為止，還沒有一種理想的動物模型被認為對所有的新生兒HIE研究適用。雖然有些模型在某些方面明顯優于其他模型，但這取決于它所特定的研究問題，譬如胎羊及新生羊羔和新生豬適用于急性及亞急性的生理和代謝機制的研究，而齒鼠類和靈長類動物經常被用于長期的神經病理學及行為學后果的試驗研究中。 5 期望 隨著時間的推移和研究的深入，各種HIE動物模型也處于不斷的改進之中，譬如各種新技術新方法的使用（如采用外科顯微鏡來做各種結扎手術），誘導腦損傷過程中缺氧缺血時間和程度也不斷在變化等。隨著基因技術的迅速發展，各種轉基因動物也在該試驗研