1、補課安排補課安排第第7周周周周7第第11節節N1-104第第8周周周周3第第7節節N1-121 第第 六六 章章 基因操作中大分子的分離和分析基因操作中大分子的分離和分析第一節第一節 DNADNA的分離、檢測和純化的分離、檢測和純化第二節第二節 RNARNA的分離、檢測和純化的分離、檢測和純化第三節第三節 分子雜交分子雜交第四節第四節 RNARNA作圖和端點分析作圖和端點分析第五節第五節 重組重組DNADNA分子導入大腸桿菌分子導入大腸桿菌第一節第一節 DNA的分離、檢測和純化的分離、檢測和純化一、大腸桿菌質粒一、大腸桿菌質粒DNA的分離和純化的分離和純化二、二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖

2、凝膠電泳三、聚丙烯酰胺凝膠電泳三、聚丙烯酰胺凝膠電泳四、脈沖場凝膠電泳四、脈沖場凝膠電泳五、五、DNA片段的純化片段的純化一、大腸桿菌質粒一、大腸桿菌質粒DNA的分離和純化的分離和純化依據是利用分子依據是利用分子大小大小不同和質粒不同和質粒DNA的的超螺旋超螺旋共價閉合環狀結構共價閉合環狀結構的特點來進行分離。的特點來進行分離。目前最常用的是目前最常用的是堿裂解法堿裂解法。1 堿裂解法提取大腸桿菌質粒堿裂解法提取大腸桿菌質粒DNA原理原理 堿裂解法堿裂解法是基于染色體是基于染色體DNA與質粒與質粒DNA變性與復變性與復性的差異性的差異而達到分離目的。而達到分離目的。在在pH高達高達12.5的堿

3、性條件下，染色體的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性，質粒斷裂，雙螺旋結構解開而變性，質粒DNA的大部的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈鏈不會完全分離不會完全分離。當以當以pH4.6的的KAc高鹽緩沖液調節其高鹽緩沖液調節其pH至至中性中性時，時，變性的質粒變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在又恢復原來的構型，保存在溶液溶液中中，而染色體，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結不能復性而形成纏連的網狀結構。構。通過離心，染色體通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子與不穩定的大分子RNA、蛋白質蛋白質

4、-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。復合物等一起沉淀下來而被除去。堿抽提法所用試劑的生化作用堿抽提法所用試劑的生化作用 提取過程提取過程中所用的材料有中所用的材料有LBLB培養基、葡萄糖培養基、葡萄糖/Tris/EDTA/Tris/EDTA溶液溶液(5Ommol/L(5Ommol/L葡萄糖；葡萄糖；25mmol/L 25mmol/L TrisHClTrisHCl；pH8.0pH8.0，lOmmol/L EDTA)lOmmol/L EDTA)、TETE緩沖緩沖液、液、3mol/L3mol/L乙酸鉀溶液、乙酸鉀溶液、NaOH-SDSNaOH-SDS溶液、溶溶液、溶菌酶液、異丙醇、菌酶液、異丙醇、

5、100%100%乙醇和乙醇和70%70%乙醇等。乙醇等。 溶菌酶溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌體溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。糖苷鍵，因而具有溶菌作用。 葡萄糖葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，葡萄糖增加溶液粘度，維持滲透維持滲透壓壓，防止，防止DNA受機械剪切力作用而降解。受機械剪切力作用而降解。 EDTA:EDTA螯合螯合Mg2+和和Ca2+等金屬離子，等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用的降解作用,同時有利于溶菌酶的作用。同時有利于溶菌酶的作用。 NaOH-SDSNa

6、OH-SDS液液: :NaOHNaOH濃度為濃度為0.2 mol/L0.2 mol/L，加，加抽提液時，該系統的抽提液時，該系統的pHpH就高達就高達12.612.6，因，因而促使染色體而促使染色體DNADNA與質粒與質粒DNADNA的變性。的變性。SDSSDS是是離子型表面活性劑，它可以溶解細胞離子型表面活性劑，它可以溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因溶解膜蛋白而膜上的脂質與蛋白，因溶解膜蛋白而破破壞細胞膜、解聚細胞中的核蛋白壞細胞膜、解聚細胞中的核蛋白，還能，還能與蛋白質結合成為與蛋白質結合成為R-O-S0R-O-S03 3- -RR+ +- -蛋白質蛋白質的復合物的復合物, ,使蛋白質變性沉淀

7、下來。使蛋白質變性沉淀下來。KAc:KAc: pH4.8pH4.8的的KAcKAc溶液是為了把溶液是為了把pHl2.6pHl2.6的的抽提液調節至中性，使變性的質粒抽提液調節至中性，使變性的質粒DNADNA能能夠復性，并能穩定存在。夠復性，并能穩定存在。高鹽高鹽3mol/L KAc3mol/L KAc有利于變性的大分子染色有利于變性的大分子染色體體DNADNA、RNARNA以及以及SDS-SDS-蛋白復合物的凝聚蛋白復合物的凝聚而沉淀。染色體而沉淀。染色體DNADNA因為中和了核酸上的因為中和了核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與電荷，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與RNARNA、SDS-S

8、DS-蛋白復合物作用后，形成鉀鹽蛋白復合物作用后，形成鉀鹽形式復合物，使沉淀更完全。形式復合物，使沉淀更完全。 無水乙醇無水乙醇: :沉淀沉淀DNADNA，它的優點是可以任，它的優點是可以任意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不會意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不會起任何化學反應，對起任何化學反應，對DNADNA很安全。很安全。DNADNA溶溶液是液是DNADNA以水合狀態穩定存在，當加入乙以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去醇時，乙醇會奪去DNADNA周圍的水分子，使周圍的水分子，使DNADNA失水而易于聚合。失水而易于聚合。 酚酚- -氯仿氯仿: :酚與氯仿是非極性分子，水是酚與氯仿是非極

9、性分子，水是極性分子，當蛋白水溶液與酚或氯仿混極性分子，當蛋白水溶液與酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白質失去水合狀態而或氯仿擠去，使蛋白質失去水合狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的水相下面，從而與溶解在水相中的DNADNA分分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。留在最下層。異戊醇異戊醇: :異戊醇能異戊醇能降低分子表面張力降低分子表面張力，能，能減少抽

10、提過程中泡沫的產生。同時異戊減少抽提過程中泡沫的產生。同時異戊醇醇有助于分相有助于分相，使離心后的上層水相、，使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。持穩定。 152 通過試劑盒分離純化大腸桿菌質粒DNA 二、二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳1、凝膠電泳的基本原理、凝膠電泳的基本原理一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當的電極。它與電場強度和電泳分度移向適當的電極。它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數成正比。就是說，子本身所攜帶的凈電荷數成正比。就是說，電場強度越大，電泳

11、分子所攜帶的凈電荷數電場強度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳遷移率。遷移率。2、影響電泳遷移速率的因素：、影響電泳遷移速率的因素：1 ） 分子篩效應分子篩效應DNA分子在高于等電點的分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度

12、向正極方向移動。在一定的因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效分子的遷移速度取決于分子篩效應，即應，即DNA分子本身的大小和構型。分子本身的大小和構型。 2）相對分子質量）相對分子質量具有具有不同的相對分子質量不同的相對分子質量的的DNA片段泳動速度不一片段泳動速度不一樣，可進行分離。樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關系。比關系。當提取到的質粒當提取到的質粒DNA樣品中還有染色體樣品中還有染色體DNA或或RNA時，在凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區帶，由時，

13、在凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區帶，由此可分析樣品的純度。此可分析樣品的純度。 3）構型）構型質粒質粒DNA超螺旋超螺旋(SC)、開環狀、開環狀(OC)、線狀、線狀(L) 3種構型種構型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型分子遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的為開分子遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的為開環狀分子。環狀分子。3、DNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳1）DNA的顯示原理：的顯示原理： 制備瓊脂糖凝膠時加入制備瓊脂糖凝膠時加入溴化乙錠溴化乙錠指示劑，溴化乙指示劑，溴化乙錠錠(EB)在紫外光照射下能發射在紫外光照射下能發射桔

14、紅色的熒光桔紅色的熒光。熒光的強度熒光的強度正比于正比于DNA的含量。若用的含量。若用薄層分析掃描儀薄層分析掃描儀檢測，只需要檢測，只需要5lO ng DNA，就可以從照片上比較，就可以從照片上比較鑒別。如用鑒別。如用肉眼肉眼觀察，可檢測到觀察，可檢測到0.010.1g的的DNA。EB染色原理染色原理當當DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中的的EB就插入就插入DNA分子中形成熒光絡合物，使分子中形成熒光絡合物，使DNA發發射的熒光增強幾十倍。射的熒光增強幾十倍。分離不同大小分離不同大小DNADNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度片段的合適瓊脂糖凝膠濃度2）

15、瓊脂糖凝膠電泳的操作過程）瓊脂糖凝膠電泳的操作過程A、緩沖液制備緩沖液制備B、EB母液配制：母液配制：10mg/ml，在，在4下保存下保存C、將點樣梳洗凈干燥放入膠板中將點樣梳洗凈干燥放入膠板中D、瓊脂糖膠板的制備：瓊脂糖膠板的制備： 稱量加入三角瓶一定的瓊脂糖粉末，按所需凝稱量加入三角瓶一定的瓊脂糖粉末，按所需凝膠濃度加入適量體積的緩沖液，將三角瓶塞口，微膠濃度加入適量體積的緩沖液，將三角瓶塞口，微波爐中波爐中融化融化。 融化好后冷卻到融化好后冷卻到60左右，加入左右，加入EB溶液，至最溶液，至最終濃度為終濃度為0.5ug/ml。搖勻倒入放置好點樣梳的膠板。搖勻倒入放置好點樣梳的膠板中，排走

16、氣泡。室溫放置中，排走氣泡。室溫放置30-45min。2）瓊脂糖凝膠電泳的操作過程）瓊脂糖凝膠電泳的操作過程E、加樣和電泳：加樣和電泳： 將膠板放入電泳槽，注入緩沖液，使液面高于將膠板放入電泳槽，注入緩沖液，使液面高于膠面膠面1-2mm，排出加樣孔內的氣泡，用微量移液槍，排出加樣孔內的氣泡，用微量移液槍加入加入DNA樣品。接通電源，調好電壓和電泳時間。樣品。接通電源，調好電壓和電泳時間。可根據可根據溴酚蘭的位置溴酚蘭的位置結束電泳，關閉電源。結束電泳，關閉電源。F、取出凝膠，置于紫外投射儀上，調好相機焦距拍取出凝膠，置于紫外投射儀上，調好相機焦距拍照照2）瓊脂糖凝膠電泳的操作過程）瓊脂糖凝膠電

17、泳的操作過程2）瓊脂糖凝膠電泳的操作過程）瓊脂糖凝膠電泳的操作過程常用的常用的Marker三、聚丙烯酰胺凝膠電泳三、聚丙烯酰胺凝膠電泳特點：特點：分辨率高分辨率高適于寡聚核苷酸及適于寡聚核苷酸及DNA序列分析，序列分析，DNA500bp載樣量大載樣量大回收回收DNA純度高純度高PAGE裝置電 泳PAGE應用范圍分離、純化和鑒定分離、純化和鑒定RNA和小分子和小分子DNA DNA序列分析序列分析 PCR產物鑒定產物鑒定 蛋白質的檢測和分析蛋白質的檢測和分析 四 、四 、 脈 沖 場 凝 膠 電 泳脈 沖 場 凝 膠 電 泳 ( p u l s e d - f i e l d g e l elec

18、trophoresis PFGE)采用定時改變電場方向的交變電源采用定時改變電場方向的交變電源，每次電流方向改，每次電流方向改變后持續變后持續1秒到秒到5分鐘左右，然后再改變電流方向，分鐘左右，然后再改變電流方向，反復循環，所以稱之為脈沖式交變電場。反復循環，所以稱之為脈沖式交變電場。專門針對專門針對大片段大片段DNA的分析檢測方法。的分析檢測方法。+- - -2五、五、DNA片段的純化片段的純化DNA經過酶切并通過瓊脂糖凝膠電泳分析在凝膠上會經過酶切并通過瓊脂糖凝膠電泳分析在凝膠上會呈現呈現DNA條帶條帶，從中分離特定大小的，從中分離特定大小的DNA片段可用片段可用于進一步深入的研究。于進一

19、步深入的研究。常用的常用的DNA純化方法有：純化方法有：低熔點瓊脂糖凝膠電泳法低熔點瓊脂糖凝膠電泳法、透析袋電洗脫法透析袋電洗脫法、氯化銫、氯化銫-溴化乙錠連續梯度離心法、溴化乙錠連續梯度離心法、離子交換層析法、離子交換層析法、 “基因純基因純”試劑純化等。試劑純化等。低熔點瓊脂糖凝膠電泳法低熔點瓊脂糖凝膠電泳法首先利用低熔點瓊脂糖凝膠電泳首先利用低熔點瓊脂糖凝膠電泳DNA片段，分離目的片段，分離目的條帶條帶DNA，然后，然后紫外光紫外光下切割含目的下切割含目的DNA條帶的膠條帶的膠塊，利用塊，利用膠回收試劑盒膠回收試劑盒回收純化回收純化DNA片段。片段。試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質材料在一

20、定的高鹽緩試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質材料在一定的高鹽緩沖系統下高效專一地吸附沖系統下高效專一地吸附DNA、RNA的原理，配備的原理，配備設計獨特的離心吸附柱式結構，使用常規臺式高速離設計獨特的離心吸附柱式結構，使用常規臺式高速離心機，在幾分鐘之內即可以高效回收核酸片段。心機，在幾分鐘之內即可以高效回收核酸片段。1）切膠，放入）切膠，放入1.5ml離心管中；離心管中；2） 加入溶膠液，置加入溶膠液，置55水浴水浴10分鐘，分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化；使瓊脂糖塊完全溶化；3）瓊脂糖液移入吸附柱，）瓊脂糖液移入吸附柱，12000 rpm 室溫離心室溫離心1分鐘，倒掉收集管中分鐘，倒掉收集管中的液體

21、；的液體；4）在吸附柱中加入漂洗液，室溫靜）在吸附柱中加入漂洗液，室溫靜置置1分鐘后，分鐘后， 12000rpm 室溫離心室溫離心30秒，倒掉收集管中的液體；秒，倒掉收集管中的液體；5）重復漂洗一次；）重復漂洗一次；6） 12000rpm 室溫空離心室溫空離心1分鐘；分鐘；7）將吸附柱放入一個）將吸附柱放入一個干凈的干凈的1.5ml的的離心管離心管中，在吸附膜中央加入中，在吸附膜中央加入30ul洗洗脫緩沖液，室溫靜置脫緩沖液，室溫靜置2分鐘后，分鐘后， 12000rpm 室溫離心室溫離心1分鐘；分鐘；8）瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產物；）瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產物；凝膠純化結果示意圖透析袋電洗脫法

22、透析袋電洗脫法 適用于適用于小劑量小劑量DNA純化和酶切純化和酶切DNA片段回收。片段回收。步驟：步驟：電泳分帶。電泳分帶。切膠，裝入透析袋，進行電泳切膠，裝入透析袋，進行電泳1-2h后，再反向電泳后，再反向電泳1-2min。洗脫液離心。洗脫液離心。轉移，加入轉移，加入2倍體積無水乙醇混勻，于倍體積無水乙醇混勻，于-20放置過夜放置過夜沉淀后，離心后去除上清液，最后把沉淀物溶于沉淀后，離心后去除上清液，最后把沉淀物溶于TE緩沖液中，緩沖液中，-20保存備用。保存備用。 通過凝膠電泳回收的通過凝膠電泳回收的DNA樣品，因檢測需要樣品，因檢測需要而含有而含有溴化乙錠溴化乙錠(EB)，會，會影響限制

23、性核酸內切影響限制性核酸內切酶的切割酶的切割，因此有必要去掉插入到，因此有必要去掉插入到DNA中的中的EB，常采用的方法有：，常采用的方法有：正丁醇正丁醇(或異戊醇或異戊醇)抽提抽提或或Dowex(道埃克斯道埃克斯)樹脂層析法等。樹脂層析法等。DNA的濃縮的濃縮 當提取的當提取的DNA溶液的濃度達不到實驗要求時，溶液的濃度達不到實驗要求時，必須進行必須進行DNA溶液的濃縮。實驗室常用的方法溶液的濃縮。實驗室常用的方法有：有： 乙醇沉淀法、乙醇沉淀法、 正丁醇抽提法和聚乙二醇正丁醇抽提法和聚乙二醇濃縮法等。濃縮法等。 乙醇沉淀乙醇沉淀 DNA不溶于乙醇，因此可用乙醇來沉淀不溶于乙醇，因此可用乙醇

24、來沉淀DNA以達到純化以達到純化DNA的目的。乙醇沉淀是濃縮的目的。乙醇沉淀是濃縮DNA的的常用方法。常用方法。1、按、按DNA溶液量的溶液量的1/10體積加入體積加入3mmol/L NaAc。2、加、加2.5倍體積的預冷倍體積的預冷100%乙醇，蓋上蓋子混勻。乙醇，蓋上蓋子混勻。3、-70靜置靜置15min，或，或-20 靜置靜置1h以上。以上。4、4 、15000r/min，離心，離心15min，沉淀，沉淀DNA。5、棄上清。、棄上清。6、加、加70%乙醇適量，漂洗沉淀，再次離心。乙醇適量，漂洗沉淀，再次離心。7、干燥、干燥1030min。8、加、加TE溶解。溶解。鹽能中和核酸上的電荷，因

25、此鹽能中和核酸上的電荷，因此易使易使DNA沉淀，但加入過多易沉淀，但加入過多易產生鹽析。產生鹽析。（四）（四）DNA的定量和純度測定的定量和純度測定 DNA樣品的濃度的測定，一般采用樣品的濃度的測定，一般采用紫外光譜分析、紫外光譜分析、EB熒光分析熒光分析、水平式瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰、水平式瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法和脈沖電泳法等。胺凝膠電泳法和脈沖電泳法等。 紫外光譜分析法紫外光譜分析法 紫外光譜分析法的原理基于紫外光譜分析法的原理基于DNA(或或RNA)分子在分子在260nmm處有特異的紫外吸收峰且吸收強度與系處有特異的紫外吸收峰且吸收強度與系統中統中DNA或或RNA的濃

26、度成正比。的濃度成正比。分子形狀、雙分子形狀、雙鏈與單鏈鏈與單鏈之間的轉換也會導致吸收水平的改變，之間的轉換也會導致吸收水平的改變，但是這種偏差可以用特定的公式來校正。該法但是這種偏差可以用特定的公式來校正。該法的特點是的特點是準確、簡便，但所需儀器較昂貴。準確、簡便，但所需儀器較昂貴。衡量所提取衡量所提取DNA的純度可用的純度可用OD260與與OD280的比值表示，的比值表示，OD260/OD280對對DNA而言其值大約為而言其值大約為1.8。當當OD260/OD280大大于于1.8則可能有則可能有RNA污染污染。當當OD260/ OD280小于小于1.8時則有時則有蛋白質污染蛋白質污染。雙

27、鏈雙鏈DNA的的OD260為為 1時相當于濃度為時相當于濃度為50g/mL。單鏈單鏈DNA的的OD260為為 1時相當于濃度為時相當于濃度為40g/mL。寡核酸的寡核酸的OD260為為 1時相當于濃度為時相當于濃度為20-40g/mL。EB熒光分析法熒光分析法 由于結合于由于結合于DNA分子之上的分子之上的EB的量與的量與DNA分子分子長長度和數量度和數量成正比，則熒光強度可以表示成正比，則熒光強度可以表示DNA量量的多少。的多少。EB是嫌疑性的致突變物質。是嫌疑性的致突變物質。第二節第二節 RNA的分離、檢測和純化的分離、檢測和純化細胞中的核酸：細胞中的核酸：DNA和和RNA。RNA：rRN

28、A、 tRNA、 mRNA 。 80%85% rRNA(28S、18S、5S rRNA)。 15%20%低分子量低分子量RNA(如如tRNA、核內小、核內小分子分子RNA等）。等）。 1%5% mRNA，一般按，一般按2%計算。計算。Trizol法提取細胞總法提取細胞總RNA RNA實驗失敗的主要原因是實驗失敗的主要原因是RNA酶的污染酶的污染。由于由于RNA酶酶廣泛存在而穩定廣泛存在而穩定，可耐受多種處理而不被，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，只要存在少量的滅活，如煮沸、高壓滅菌等，只要存在少量的RNA酶就會引起酶就會引起RNA的降解，而所制備的的降解，而所制備的RNA的的純度

29、和純度和完整性完整性又可直接影響又可直接影響RNA分析的結果，所以建立一分析的結果，所以建立一個無個無RNA酶的環境對于制備酶的環境對于制備RNA很重要。很重要。常用的常用的RNA酶抑制劑：酶抑制劑：焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPC）：與）：與RNA酶的活性基團組酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合，有高致癌性。（實驗準備階段氨酸的咪唑環結合，有高致癌性。（實驗準備階段使用）使用）異硫氰酸胍、氯仿：提取異硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同時也使同時也使RNA酶失活。酶失活。1. RNA酶的蛋白抑制劑（酶的蛋白抑制劑（RNasin）：酸性糖蛋白。）：酸性糖蛋白。（合成（合成cDNA階段使用）階段使用）

30、1.在實驗室最好有專門的在實驗室最好有專門的RNA操作區，離心機、操作區，離心機、移液器、試劑等專用。移液器、試劑等專用。RNA操作區應保持清潔操作區應保持清潔，并定期進行除菌。，并定期進行除菌。 2.相關耗材相關耗材(Ep管、管、Tip頭頭)應先用應先用0.1% DEPC水浸水浸泡過夜并高壓消毒。也可直接使用廠家供應的泡過夜并高壓消毒。也可直接使用廠家供應的無無RNase的的Ep管、管、Tip頭。頭。 3.金屬器械和玻璃器皿應在使用前于金屬器械和玻璃器皿應在使用前于180的高溫的高溫下干烤下干烤6hr或更長時間。或更長時間。注意事項注意事項4.塑料器皿可用塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡

31、或用氯仿沖洗水浸泡或用氯仿沖洗5.配制的溶液應盡可能加入配制的溶液應盡可能加入DEPC至終濃度至終濃度0.1%處處理理12hr以上，然后用高壓滅菌除去殘留的以上，然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。（不能用。（不能用DEPC或高壓滅菌的試劑，如或高壓滅菌的試劑，如Tris、DTT等，應當用等，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制處理過的無菌雙蒸水配制，然后經，然后經0.22m濾膜過濾除菌）濾膜過濾除菌）6.人的唾液和汗液含有人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中應戴手酶，故在操作中應戴手套，避免講話。套，避免講話。Trizol是一種是一種苯酚苯酚與與異硫氰酸胍異硫氰酸胍(GTC)的混合物的混合物

32、，異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使，異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質分離。與蛋白質分離。酸性酸性苯酚苯酚促使促使RNA進入水相，加入氯仿可抽提進入水相，加入氯仿可抽提酸性的苯酚，離心后，酸性的苯酚，離心后，RNA保留在水相中，保留在水相中，DNA和和蛋白質保留在有機相中。蛋白質保留在有機相中。水相加入異丙醇沉淀水相加入異丙醇沉淀RNA，從而得到純化的總，從而得到純化的總RNA。nTrizol法提取原理法提取原理真核生物真核生物mRNA的純化的純化（1）寡聚）寡聚(dT)親和層析柱分離親和層析柱分離mRNA（2）磁性分離技術純化）磁性分離技術純化mRNA（1

33、）寡聚）寡聚(dT)親和層析柱分離親和層析柱分離mRNA利用利用mRNA 3末端含有末端含有Poly（A+）的特點，在的特點，在RNA流經流經寡聚（寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即）纖維柱后，即可得到較高純度的可得到較高純度的mRNA磁性分離技術純化磁性分離技術純化mRNA先將連有生物素的先將連有生物素的oligo(dT)引物與引物

34、與mRNA3-端的端的polyA一起雜交；一起雜交；加入連有生物素結合蛋白的磁球，使雜交體與磁球加入連有生物素結合蛋白的磁球，使雜交體與磁球結合；結合；通過磁場作用，使連有雜交體的磁球與其他通過磁場作用，使連有雜交體的磁球與其他RNA分分離；離；通過洗脫將連在磁球上的通過洗脫將連在磁球上的mRNA洗脫下來而得到純洗脫下來而得到純化的化的mRNA。該方法簡單、迅速、不易引起該方法簡單、迅速、不易引起mRNA的降解。的降解。RNA的電泳檢測RNA的濃度和純度可通過測的濃度和純度可通過測試其試其OD260來判斷，來判斷， OD260為為 1時相當于濃度為時相當于濃度為40g/mLg/mL。檢測：檢測

35、：瓊脂糖凝膠電泳法、聚瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法。丙烯酰胺凝膠電泳法。28S18S總RNA電泳條帶第三節第三節 分子雜交分子雜交 一一、SouthernSouthern雜交雜交二二、NorthernNorthern雜交雜交三三、菌落原位雜交菌落原位雜交四四、WesternWestern雜交雜交分子雜交分子雜交 (molecule hybridization)分子雜交分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質分析方法，用已知標記的核酸分子或蛋白質分析方法，用已知標記的核酸分子或蛋白質分子檢測混合樣品中未知核酸分子或蛋白質分子檢測混合樣品中未知核酸分子或

36、蛋白質分子，以及其相對分子量大小。質分子，以及其相對分子量大小。根據其根據其檢測對象檢測對象的不同可分為的不同可分為 Southern 雜交、雜交、Northern 雜交和雜交和 Western 雜交雜交 ，及由此簡及由此簡化的化的斑點雜交、狹線雜交和菌落雜交。斑點雜交、狹線雜交和菌落雜交。 分子雜交可在分子雜交可在DNA與與DNA、RNA與與RNA或或RNA與與DNA的二條單鏈之間進行的二條單鏈之間進行，也可能在蛋白質，也可能在蛋白質與蛋白質之間進行。與蛋白質之間進行。 核酸分子雜交是指核酸分子核酸分子雜交是指核酸分子(DNA或或RNA)在在變變性性以后，在以后，在復性復性的過程中兩個的過程

37、中兩個不同來源的且同源的不同來源的且同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過程。核酸分子形成雜合雙鏈的過程。通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標記的探針與被固定的分子雜交，經然后用放射性標記的探針與被固定的分子雜交，經顯影后顯示出目的顯影后顯示出目的DNA或或RNA分子所處的位置。分子所處的位置。 一、一、SouthernSouthern雜交雜交 這種方法是這種方法是E.M.Southern1975E.M.Southern1975年建立年建立, ,是進是進行基因組行基因組DNADNA特定序列定位的通用方法。特定序列定位的通用方法。（一）（一）

38、SouthernSouthern雜交的操作步驟雜交的操作步驟1.1.預處理：預處理： （1 1）用限制性內切酶將基因組）用限制性內切酶將基因組DNADNA進行進行酶切酶切。 （2 2）將酶切后的）將酶切后的DNADNA片段進行瓊脂糖凝膠片段進行瓊脂糖凝膠電泳電泳。 （3 3）凝膠泡在）凝膠泡在強堿溶液強堿溶液中，雙鏈的中，雙鏈的DNADNA樣品樣品變性變性。 （4 4）用酸）用酸中和中和，使單鏈，使單鏈DNADNA維持其單鏈狀態維持其單鏈狀態2.2.原位轉移：原位轉移： 將凝膠上的將凝膠上的單鏈單鏈DNADNA轉移到尼龍膜轉移到尼龍膜上。上。3.3.固定：固定： 在真空烤箱里，在真空烤箱里，8

39、080下烤下烤1-3h1-3h。將核酸樣品進。將核酸樣品進一步一步固定固定在濾膜上在濾膜上4.4.雜交：雜交：雜交之前須有一個雜交之前須有一個預雜交預雜交，封阻膜的背景，避免雜交，封阻膜的背景，避免雜交時背景吸附探針。時背景吸附探針。封閉試劑成分主要是大量的非同封閉試劑成分主要是大量的非同源性的核酸或蛋白質等。源性的核酸或蛋白質等。將濾膜移入含有放射性同位素標記的將濾膜移入含有放射性同位素標記的探針探針分子溶液中，分子溶液中，濾膜上的單鏈濾膜上的單鏈DNADNA分子與探針分子通過互補配對進分子與探針分子通過互補配對進行行雜交雜交，形成雜種分子。，形成雜種分子。 5.漂洗：漂洗： 將濾膜上沒有和

40、單鏈將濾膜上沒有和單鏈DNA樣品結合的游離的探針樣品結合的游離的探針分子漂洗下來。分子漂洗下來。6.放射自顯影：放射自顯影： 在在X光曝射下進行放射自顯影形成自顯影圖片。光曝射下進行放射自顯影形成自顯影圖片。7.比較鑒定：比較鑒定： 將放射自顯影圖片上的譜帶與凝膠上的譜帶進行比將放射自顯影圖片上的譜帶與凝膠上的譜帶進行比較。確定與探針分子結合的較。確定與探針分子結合的DNA分子是凝膠上分子是凝膠上DNA鏈的那個片段。鏈的那個片段。1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過毛細管滲析法轉移膠中的通過毛細管滲析法轉移膠中的DNA3.固定膠中的固定膠中的DNA4.預雜

41、交和雜交預雜交和雜交(放射性和熒光檢測放射性和熒光檢測)5.結果檢測，比較鑒定。結果檢測，比較鑒定。（一）（一）SouthernSouthern雜交的操作步驟雜交的操作步驟 Southern Southern印跡雜交方法印跡雜交方法操作簡單，結果十分靈敏。操作簡單，結果十分靈敏。在理想的條件下，應用放射性同位素標記的特異性探在理想的條件下，應用放射性同位素標記的特異性探針和放射自顯影技術，即使每帶電泳條帶僅含有針和放射自顯影技術，即使每帶電泳條帶僅含有2ng2ng的的DNADNA也能被清晰地檢測出來。也能被清晰地檢測出來。 1.硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜 在印跡技術中，硝酸纖維素濾膜是目前應

42、用最廣的一在印跡技術中，硝酸纖維素濾膜是目前應用最廣的一種固相支持物，但它存在一些不足之處種固相支持物，但它存在一些不足之處: （1）硝酸纖維素濾膜是依賴）硝酸纖維素濾膜是依賴疏水性相互作用疏水性相互作用結合結合DNA的，這種結合并不十分牢固。的，這種結合并不十分牢固。（二）（二）Southern雜交的雜交濾膜雜交的雜交濾膜（2）硝酸纖維素濾膜）硝酸纖維素濾膜質地較脆弱質地較脆弱，容易碎裂。，容易碎裂。（3）硝酸纖維素濾膜與核酸的結合）硝酸纖維素濾膜與核酸的結合有賴于高鹽有賴于高鹽濃度濃度。（4）硝酸纖維素濾膜對于）硝酸纖維素濾膜對于小分子質量小分子質量的的DNA片片段段 (特別是小于特別是小

43、于200bp的的DNA片段片段)結合能力結合能力不不強強。2. 尼龍膜尼龍膜優點：優點：結合結合DNA和和RNA的能力的能力強于強于硝酸纖維素濾膜，對小硝酸纖維素濾膜，對小分子質量的核酸也能較好地結合。分子質量的核酸也能較好地結合。尼龍膜韌性強，操作較方便，對離子濃度要求不高，尼龍膜韌性強，操作較方便，對離子濃度要求不高，可重復用于雜交。可重復用于雜交。缺點：缺點：雜交信號雜交信號本底本底較硝酸纖維素濾膜較硝酸纖維素濾膜高高。將將RNA分子分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。行核酸

44、雜交的一種實驗方法。二、二、 Northern雜交雜交 Northern雜交的過程雜交的過程 提取總提取總RNA。 分離分離mRNA。利用親和層析的原理純化利用親和層析的原理純化mRNA。 制備制備RNA探針。探針。根據根據mRNA序列合成同源序列合成同源DNA探針，或以探針，或以cDNA為探針。為探針。 Northern雜交。雜交。Northern雜交的方法包括點雜雜交的方法包括點雜交和印跡雜交，兩者都能鑒定外源基因是否得到交和印跡雜交，兩者都能鑒定外源基因是否得到轉錄，但后者還能確定轉錄，但后者還能確定mRNA分子質量大小及豐分子質量大小及豐度。度。三三 菌落原位雜交菌落原位雜交 （col

45、ony in situ hybridization）直接把直接把菌落印跡菌落印跡轉移到硝酸纖維素濾膜上，經轉移到硝酸纖維素濾膜上，經溶菌和變性溶菌和變性處理后使處理后使DNA暴露出來并與濾膜原位結暴露出來并與濾膜原位結合，再與特異性合，再與特異性DNA探針雜交，篩選出含有插入序探針雜交，篩選出含有插入序列的菌落。列的菌落。菌落原位雜交的操作步驟菌落原位雜交的操作步驟 四四 Western雜交雜交是將是將蛋白質電泳、印跡和免疫測定蛋白質電泳、印跡和免疫測定結合在一起的檢測結合在一起的檢測方法，具有很高的靈敏度（方法，具有很高的靈敏度（50 ng）。）。原理：原理：先從生物細胞中先從生物細胞中提取

46、提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質總蛋白或目的蛋白，將蛋白質樣品溶解于含有樣品溶解于含有去污劑和還原劑去污劑和還原劑的溶液中的溶液中經經SDS-PAGE電泳電泳將蛋白質按分子量大小分離，再將蛋白質按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質條帶把分離的各蛋白質條帶原位轉移原位轉移到固相膜（硝酸纖到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上維素膜或尼龍膜）上接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質溶液中溫育，以接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質溶液中溫育，以封閉其封閉其非特異性位點非特異性位點然后加入特異抗性體（然后加入特異抗性體（一抗一抗），膜上的目的蛋白（抗原），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結合）與一抗結合再加入能與一抗專一性結合

47、的帶標記的再加入能與一抗專一性結合的帶標記的二抗二抗（通常一抗（通常一抗用兔來源的抗體時，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體）用兔來源的抗體時，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體）最后通過二抗上帶標記化合物（一般為辣根過氧化物酶最后通過二抗上帶標記化合物（一般為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性反應進行檢測或堿性磷酸酶）的特異性反應進行檢測根據檢測結果，從而可得知被檢生物（植物）細胞內目根據檢測結果，從而可得知被檢生物（植物）細胞內目的蛋白的表達與否、表達量及分子量等情況。的蛋白的表達與否、表達量及分子量等情況。 Step 1. Antibody Recognitionof target protein

48、/antigenStep 2. Secondary Antibodyrecognition of primary AbStep 3. Color DevelopmentWestern雜交的操作步驟雜交的操作步驟 總結總結 Southern印跡法（印跡法（DNA印跡法印跡法,Southern blotting）：）：是一種把是一種把DNA電泳分離區帶轉移到支持膜上的技術。電泳分離區帶轉移到支持膜上的技術。 Northern印跡法（印跡法（RNA印跡法印跡法,Northern blotting）：）：Alwine等人將等人將Southern印跡法印跡法應用于應用于RNA，原理與，原理與Southe

49、rn印跡法相似。印跡法相似。 Western印跡法（蛋白質印跡法，印跡法（蛋白質印跡法，Western blotting）：）：是一種從混合蛋白質中檢出微量特是一種從混合蛋白質中檢出微量特定蛋白質的方法。定蛋白質的方法。 Eastern印跡法（印跡法（Eastern blotting）：）：也是一種也是一種蛋白質印跡法蛋白質印跡法，與，與Western印跡法印跡法不同之處不同之處是：是：先用先用等電聚焦等電聚焦-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF-PAGE）分離蛋白質，然后也是將蛋白質的分離區帶、以分離蛋白質，然后也是將蛋白質的分離區帶、以電驅動轉移方式進行了印跡。電驅動轉移方式進行

50、了印跡。一、一、RNARNA的的S1S1核酸酶作圖：分析原核酸酶作圖：分析原mRNAmRNA加工剪加工剪接為成熟接為成熟mRNAmRNA中的剪切區段和邊界。中的剪切區段和邊界。二、二、S1S1核酸酶作圖分析核酸酶作圖分析mRNAmRNA端點：端點：5 5和和3 3端端均可分析。均可分析。三、引物延伸法分析三、引物延伸法分析mRNAmRNA的端點：只能用于的端點：只能用于5 5末端的作圖。末端的作圖。第四節 RNARNA作圖和端點分析作圖和端點分析( (自學自學) )RNA的的S1核酸酶作圖核酸酶作圖分析分析mRNA端點端點引物延伸法分析引物延伸法分析mRNA的端點的端點第五節第五節 重組重組D

51、NA分子導入受體細胞分子導入受體細胞一一 選擇受體細胞的基本原則選擇受體細胞的基本原則二二 重組質粒重組質粒DNA轉化大腸桿菌轉化大腸桿菌基本概念基本概念 受體細胞受體細胞(receptor cell) 又稱為宿主細胞或寄主細胞又稱為宿主細胞或寄主細胞(host cell)等，能攝取外等，能攝取外源源DNA并使其穩定維持的細胞并使其穩定維持的細胞。 感受態感受態(competence) 細胞處于能夠細胞處于能夠吸收吸收DNA的狀態，稱為感受態。的狀態，稱為感受態。 感受態細胞感受態細胞(competent cell) 處于能夠吸收處于能夠吸收DNA狀態的細胞。狀態的細胞。 細菌轉化，細菌轉化，

52、是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的種細菌菌株的DNA，而導致性狀特征發生遺傳改變，而導致性狀特征發生遺傳改變的生命過程。的生命過程。 轉化子轉化子(transformant)：經轉化獲得外源遺傳物質經轉化獲得外源遺傳物質的細胞。的細胞。 轉化轉化(transformation):指將指將質粒質粒DNA或以它為或以它為載體構建的重組質粒導入細菌中的過程。載體構建的重組質粒導入細菌中的過程。 轉染轉染(transfection):指指病毒病毒及其重組子導入受及其重組子導入受體細胞的過程。體細胞的過程。 轉導轉導(transduction):指指噬菌體噬菌體及其重組子導入