1、定量PCRv：故障排除-407，chenyd2004年1內容提要v 實時定量故障v SNP鑒定故障2到哪里找線索？數據分析：牢記OBTExclude Outlying wells (wells that have failed)Exclude any samples with atypical plots or that “creep”, i.e. that do not exhibit bona-fide amplification (have 3 points in log phase). This may include NTCs that creep up over the thres

2、hold at 40 cycles.O:Set BaselineDefault is 3 to 15, but set it to cover as many cycles as possible (typically 1-2 cycles before the reporter dye signal begins to increase).B:Set ThresholdSet halfway point in the log part of the amplification plot. Use semi-log scale (makes the log phase of the PCR c

3、lear). A threshold for a particular assay can be set to the same value from run-to-run.T:Check instrument settings! (for 7700 only)For example, if multiplexing (Fam + Vic) select the checkbox “Use Spectral Compensation for Real Time” and re-analyse.Also:4擴增曲線5原始數據能提供大量線索6TAMRAROXFAM各波長的原始信號7ROXTAMRA

4、VICFAM實時定量故障有數據沒有標準曲線9有數據沒有標準曲線10擴增曲線斷成兩段Possible Cause:基線范圍過大，包含部分擴增信號，致使閾值偏高如：CT值 10000點，就打折弱的信號經過校正后，點與點之間的差異被放大凈高4000點Rn= FAMROX13凈高26000點解決1關 閉校 正 7000 SDS升級到v1.1 使用高質量的探針 關閉ROX校正同一樣品去掉ROX校正后15擴增曲線不是S形16探針降解ROX反應故障為什么重復性這么差？17ROX反應故障正常的原始數據18ROX反應故障蓋子未蓋緊，溶液蒸發19ROX去掉蒸發反應故障的數據，重復性很好20引物二聚體SYBR Gr

5、een I chemistry，dissociation curve analysis*Check whether the nonspecific product is primer dimerIf the nonspecific product is primer dimer，try optimization of the primer concentration*21PCR Stage Auto-Compute Error7700 SDS v1.7問題:結果分析後出現以下a.Amplification Plot中沒有數據根據Plate窗口每孔的亮點有反應Amplification Plot

6、的X軸(cycle)只顯示0到1無法關閉視窗b.c.0122No Ct value, but “INF”PCR Stage Auto-Compute Error7700 SDS v1.7:可能軟件自動分析時無法確定PCR stage和Extension Step23PCR Stage Auto-Compute Error7700 SDS v1.7:解決a. 關閉分析視窗:在Use Threshold, Baseline Start, Baseline Stop中輸入0, 然後Update Calculation即可將視窗關閉b. 數據分析人工指定信號收集點 (stage 3, Step 2)

7、， 重新計算c.7000、7900、7300、7500均能自動找到信號收集點 (stage 3, Step 2)，不需手工設定24SNP鑒定故障結果，三種基因型很清楚，個別散點是因為DNA純度、用量、罕見突變等缺點： 沒有對照（NTC）沒有陽性對照（3種等位基因）建議：每板增加NTC、純合子1、純合子2和雜合子各3個，以可能出現的實驗問題。全部雜合子：兩條探針在基因組里都有同源序列（如假基因等），導致兩種信號始終同時出現，形成雜合子的假象。其他已知基因型的對照或者人工混合的對照樣品BLAST，檢查序列數據庫FAM純合子缺失模板上還有VIC探針的同源序列BLAST檢查基因數據庫VIC純合子缺失經過計算，三種基因型的比例是300：30：1， 結果可以接受。信號分得不好，與反應體系沒有最優化有關。VIC信號太弱1。VIC探針降解（光、溫度、緩沖液等影響其的因素）2。VIC反應條件不佳（溫度、濃度等）。信號連續DNA濃度差別較大加樣體積差別大槍的誤差管底沾有灰塵用吹風機吹反應失敗32同一位點第二次重復實驗完全正常， 可能是操作問題。9個數量級1倍分辨率 !熔解曲