1、質粒提取簡介及問題分析一、導論(一) 質粒提取的原理：為了方便理解，這里羅列一下堿法質粒抽提用到三種溶液：溶液I，50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH，1% SDS；溶液III，3 M 醋酸鉀，2 M 醋酸。 讓我們先來看看溶液I的作用。任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-HCl溶液，是再自然不過的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質粒的抽提本身而言幾乎沒有任何影響

2、，所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達 10 mM 的EDTA，就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要是在不太長的時間里完成質粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質粒的TE緩沖液中有EDTA。如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽質粒呢？只要用等體積的水或LB培養基來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊。 輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2%的SD

3、S等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發生了從bilayer(雙層膜)結構向micelle(微囊)結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌(不妨可以自己試一下)，自然就難高效率抽提得到質粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質粒，因為SDS也是堿性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH

4、的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關DNA變性復性的描述所導致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為什么要加SDS呢?那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩。溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白沉淀的本質。最容易產生的誤解是，當SDS碰到酸性后發生的沉淀。如果這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加2M醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現顯然與SDS

5、的加入有關系。如果在溶液II中不加SDS，也會有少量沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質。既然SDS不是遇酸發生的沉淀，那會不會是遇鹽發生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，會發現SDS在高鹽濃度下是會產生沉淀的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發現沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉(SDS)遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(PDS)，而PDS是水不溶的，因此發生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專

6、門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結合。(二)細菌的收獲和裂解。細菌的收獲可通過離心來進行，而細菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于3個因素：質粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質粒DNA的技術。 盡管針對質粒和宿主的每一種組合分別提出精確的裂解條件不切實際

7、，但仍可據下述一般準則來選擇適當方法，以取得滿意的結果。1、大質粒(大于15kb)容易受損，故應采用漫和裂解法從細胞中釋放出來。將細菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進生處理，破壞細胞壁和細胞外膜，再加入SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法最大限度地減小了從具有正壓的細菌內部把質粒釋放出來所需要的作用力。2、可用更劇烈的方法來分離小質粒。在加入EDTA后，有時還在加入溶菌酶后讓細菌暴露于去污劑，通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環質粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態而不能彼此分開。當條件恢復正常時，質粒DNA鏈迅速得到準確配置，重新形

8、成完全天然的超螺旋分子。3、一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類，當隨后用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心進行質粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區帶。因此很難避免質粒DNA內污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質粒時，不宜使用煮沸法。4、當從表達內切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA 株，如HB101) 中小量制備質粒時，建議不使用煮沸法。因為煮沸不能完全滅活內切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時，質粒DNA會被降解。但如果通過

9、一個附加步驟(用酚：氯仿進行抽提)可以避免此問題。5、目前這一代質粒的拷貝數都非常高，以致于不需要用氯霉素進行選擇性擴增就可獲得高產。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質粒DNA的產量，而是要降低細菌細胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細菌裂解物，處理起來煞為費事，而在對數中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現象。有氯霉素存在時從較少量細胞獲得的質粒DNA的量以與不加氯霉素時從較大量細胞所得到的質粒DNA的量大致相等。(三)質粒DNA的純化。常用的純化方法都利用了質粒DNA 相對較小及共價閉合環狀這樣兩個性質。如，用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心分離質粒和染色體DNA 就取

10、決于溴化乙錠與線狀以及與閉環DNA分子的結合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入堿基之間而與DNA結合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續結合更多的染料，直至達到飽和(每2個堿基對大約結合1個溴化乙錠分子)。由于染料的結合量有所差別，線狀和閉環DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質粒DNA 的首選方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層

11、析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。二、質粒DNA的小量制備(一)細菌的收獲和裂解。1、收獲。1) 將2ml含相應抗生素的LB加入到容量為15ml 并通氣良好(不蓋緊)的試管中，然后接入一單菌落，于30劇烈振搖下培養過夜。2) 將1.5ml培養物倒入離心管中，4、12000g離心30秒，將剩余的培養物貯存于4。3) 吸去培養液，使細菌沉淀盡可能干燥。2、堿法裂解。1) 將細菌沉淀，所得重懸于100l用冰預冷的溶液I中，劇烈振蕩。溶液I可成批配制，高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4。須確使細菌沉淀在溶液I中完全分散。2) 加200l新配制的溶液。蓋緊管口，快速顛倒離心管5

12、次，以混合內容物。應確保離心管的整個內表面均與溶液接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。3) 加150l用冰預冷的溶液。蓋緊管口，將管倒置后溫和地振蕩10秒鐘溶液在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3-5分鐘。4) 用離心機于4、12000g離心5分種，將上清轉移到另一離心管中。5) 可做可不做：加等量酚：氯念，振蕩混勻， 用微量離心機于4 以12000g離心 2分鐘，將上清轉移到另一良心管中。有些工作者認為不必用酚：氯仿進行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會得到可耐受限制酶切反應的DNA。6) 用2倍體積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合， 于室溫放置2分鐘。7) 用

13、微量離心機于4以12 000g離心5分鐘。8) 小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。9) 用1ml70%乙醇于4洗滌雙鏈DNA沉淀，去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。i. 此法制備的高拷貝數質粒(如Xf3或pUC)，其產量一般約為：每毫升原細菌培養物3-5g。ii. 如果要通過限制酶切割反應來分析DNA，可取1l DNA溶液加到另一含8l水的微量離心管內，加1l 10×限制酶緩沖液和1單位所需限制酶， 在適宜溫育1-2小時。將剩余的DNA貯存于-20。iii. 此方法按適當比例放大可適用于100ml細菌培養物：。3、煮沸裂解。1

14、) 將細菌沉淀，所得重懸于350lSTET中。STET：0.1mol/L NaCL，10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，5% Triton X-100。2) 加25l新配制的溶菌酶溶液10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發揮作用。3) 將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40秒。4) 用微量離心機于室溫以12000g離心10分種。5) 用無菌牙簽從微量離心管中去除細菌碎片。6) 在上清中加入40l 5mol/L乙酸鈉(pH5.2)和420l異丙醇，振

15、蕩混勻，于室溫放置5分鐘。7) 用微量離心機于4以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。8) 小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。9) 加1ml 70%乙醇，于4以12 000g離心2分鐘。10)按步驟8)所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因為有時沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發殆盡，管內無可見的液體(2-5)分鐘。 11

16、)用50l含無DNA酶的胰RNA酶(20g/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20。 注：當從表達內切核酸酶A的大腸桿菌株(endA 株，如HB101 )中小量制粒尤其DNA時，建議舍棄煮沸法。因為煮沸步驟不能完全滅活內切核酸酶A，以后在Mg 2 存在下溫育(V中用限制酶時)質粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟9)之間增加一步，即用酚：氯仿進行抽提，可以避免這一問題。(二) 質粒DNA小量制備的問題與對策。堿裂解和煮沸都極其可靠，重復性也很好，而且一般沒有什么麻煩。多年來，在我們實驗室中日常使用這兩種方法的過程中，只碰到過兩個問題：1、有些工作者首次進行小量制備時，有時會發

17、現質粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠。大多數情況下，用酚：氯仿對溶液進行抽提可以去除小量備物中的雜質。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA。2、在十分偶然的情況下，個別小時制備物會出現無質粒DNA的現象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。三、質粒DNA的大量制備(一) 在豐富培養基中擴增質粒許多年來，一直認為在氯霉素存在下擴增質粒只對生長在基本培養基上的細菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復制子的高拷貝數質粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產量至每500ml培養物2-5mg質粒DNA，而且重復性也很好。1

18、) 將30ml含有目的質粒的細菌培養物培養到對數晚期(DNA 600約0.6)。培養基中應含有相應抗生素，用單菌落或從單菌落中生長起來的小量液體閉關物進行接種。2) 將含相應抗生素的500ml LB或Terrific肉湯培養基(預加溫至37)施放入25ml對數晚期的培養物，于37劇烈振搖培養25小時(搖床轉速300轉/分)，所得培養物的OD 600值約為0.4。3) 可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，使終濃度為170g/ml。像pBR322一類在宿主菌內只以中等拷貝婁竿行復的質粒，有必要通過擴增。這些質粒只要從生長達到餉新一代的質粒(如pUC質粒)可復制達到很高的拷

19、貝數，因此無需擴增。這些質粒只要從生長達到飽和的細菌培養物即可大量提純。但用氯霉素進行處理，具有抑制細菌復制的優點，可減少細菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡化質粒純化的過程。所以一般說來，盡管要在生長中的細菌培養物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。4)于37劇烈振搖(300轉/分)，繼續培養12-16小時。(二) 細菌的收獲和裂解。1、收獲。1) 4以4000轉/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。2) 將細菌沉淀重懸于100ml用冰預冷的STE中。STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L

20、EDTA(pH8.0)。3) 按步驟1)所述方法離心，以收集細菌細胞。2、堿裂解法。1) 將冼過的500ml 培養物的細菌沉淀物來自收獲細菌的步驟3 重懸于10ml(18ml)溶液I中。2) 加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液10mg/ml，溶于10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。當溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。3) 加20ml(40ml)新配制的溶液。蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數次，以充分混勻內容物。于室溫放置5-10分鐘。4) 加15nl(20ml)用冰預冷的溶液。封住瓶口，搖動離心瓶數次以混勻內容物，此時應不再出現分明的兩個液相。置冰上放10分鐘，應形成一白

21、色絮狀沉淀。于0放置后所形成的沉淀應包括染體DNA、 高分子量RNA和鉀-SDS-蛋白質-膜復合物。5) 用合適轉頭于4以4000轉/分離心15分鐘，不開剎車而使轉頭自然停轉。如果細菌碎片貼壁不緊，可以5000轉/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清全部轉到另一瓶中，棄去殘留在離心管內的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液與細菌裂解物混合不充分步驟4)。6) 上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。7) 用合適轉頭于室溫以500轉/分離心15分鐘，回收核酸。如于4離心，鹽也會了生沉淀。8) 小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液

22、流盡，于室溫用70%乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。9) 用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。四、質粒DNA的純化(一) 聚乙二醇沉淀法提取質粒DNA。1、將核酸溶液所得轉入15mlCorex 管中， 再加3ml 用冰預冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉頭于4下以10000轉/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。2、將上清轉移到另一30mlCorex管內，加等量的異丙醇， 充分混勻， 用SorvallSS34轉頭(或與其相當的轉尖)于室溫以10 000轉/分離心10分

23、釧， 回收沉淀的核酸。3、小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70%乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發殆盡。4、用500l含無DNA酶的胰RNA酶(20g/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。5、加500l含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量離心機于4以12000g離心5分鐘，以回收質粒DNA。6、吸出上清，用400l TE(pH8.0)溶解質粒DNA

24、沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。7、將水相轉到另一微量離心管中，加100l 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加2倍體積(約1ml)乙醇，于室溫放置10分鐘，于4以12 000g離心5分鐘，以回收沉淀的質粒DNA。8、吸去上清，加200l處于4以12 000g離心2分鐘。9、吸去上清，敞開管口，將管置于實驗桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發殆盡。 10)用500l TE(pH8.0)溶解沉淀1：100稀釋用TE(pH8.0) 后測量OD 260，計算質粒DNA的濃度(1OD260=50g質粒DNA/ml)， 然后將DNA貯于-20。10、純化。一些試劑的生化作用原理1、溶液溶霉菌：水解菌體細胞壁

25、的主要化學成分肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。葡萄糖：增加溶液的粘度，防止DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA：金屬離子螯合劑，螯合Mg2+，Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶(DNase)對DNA的降解作用(DNase 作用時需要一定的金屬離子強度作輔基)，同時EDTA的存在，有利于溶霉菌的作用。因為溶霉菌的反應要求有較低的離子強度環境。2、溶液-NaOH-SDS液NaOH：核酸在pH值為59的溶液中是最穩定的，但pH大于12或小于3時，就會引起雙鍵之間氫鍵的解離而變性。在溶液中的NaOH濃度為0.2N，加入提取液時，該系統的pH就會高達12.6，因而促使染色體DNA與質粒

26、DNA的變性。SDS：為陰離子表面活性劑，主要功能有：溶解細胞膜上的脂肪與蛋白，從而破壞細胞膜；解聚細胞中的核蛋白SDS蛋白質結合為復合物，使蛋白變性沉淀下來，但SDS能抑制核糖核酸沒的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，以防用RNase去除RNA時受到干擾。3、溶液-3M KAc(pH4.8)溶液：KAc的水溶液呈堿性，為了調節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸，所以該溶液實際上是KAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的KAc溶液是為了把pH 12.6的抽取液pH調回到中性，使變性的質粒DNA能夠復性，并能穩定存在。而高鹽的3molL KAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以

27、及SDS-蛋白質復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷。減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS-蛋白質復合物作用后，能形成溶解度較小的鈉鹽形式復合物，使沉淀完全。4、為什么用無水乙醇沉淀DNA:此為實驗中最常用的沉淀方法。乙醇的優點是低度極性，可以以任意比例和水相混容，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液時以水合狀態穩定存在的DNA，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合。其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來代替無水乙醇(因無水乙醇價格更貴)，但加95%乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中總有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，會影響收得率。折衷的做法是初次沉淀DNA是可用95%乙醇代替無水乙醇，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用異丙醇選擇性沉淀DNA，一般在室溫下放置1530min即可。使用乙醇在低溫條件下沉淀DNA，分子運動大大減少，DNA易于聚合而沉淀，且溫度越低，DNA沉淀得越快。5、RNase處理核糖核酸后，再次沉淀DNA時為什么一定要加NaAc至最濃度達0.10.25M。在pH 8