1、    星形膠質細胞瘤惡性程度與細胞凋亡、細胞增殖的相關性研究        摘要目的：探討星形膠質細胞瘤的惡性程度與細胞凋亡、細胞增殖的相關性。方法：利用DNA凝膠電泳確定34例腫瘤細胞群體中細胞凋亡的存在，使用體視學方法計數凋亡指數(AI)、增殖指數(MI)、AI/MI比率。結果：DNA凝膠電泳26例顯示特征性的DNA梯帶，AI、MI分別隨腫瘤惡性程度增加而遞增，且AI與MI呈正相關，但AI/MI隨惡性度增高而降低。結論：腫瘤細胞群體中存在細胞凋亡，惡性腫瘤中細胞的增殖遠

2、活躍于細胞凋亡。AI/MI比率提示了細胞凋亡與增殖的關系。關鍵詞神經膠質瘤；細胞凋亡；凋亡指數；增殖指數分類號R739.41文獻標識碼A文章編號1001-7399(1999)04-0298-03Correlation among apoptosis、cell proliferation and the degrees of malignancy in astrocytomaLiu Pengchong, Liu Yan, Wu Kelan(Dept of Pathol, Tongji Medical University, Wuhan430030)ABSTRACTPurposeTo study

3、the correlation among apoptosis, proliferation and the degrees of malignancy in astrocytoma. MethodsThe existence of apoptotic cells was determined by DNA gel electrophoresis in 34 cases of astrocytoma. Apoptotic index (AI), mitotic index (MI) and AI/MI ratio were calculated by microscope. ResultsDN

4、A ladder was demonstrated in 26 cases. AI and MI gradually increased with the malignant degrees of astrocytoma respectively, but AI/MI ratio decreased. There was a positive correlation between the apoptotic and MI. ConclusionMitotic activity in malignant tumors prevails over apoptosis. The behavior

5、of the AI/MI ratio suggests a relationship between apoptosis and cell proliferation. KEY WORDSglioma; apoptosis; apoptotic index; mitotic index腫瘤的發生是細胞增殖的結果，同時與細胞凋亡的喪失有關。研究細胞凋亡是從細胞增殖的反面探討生命活動中細胞死亡的方式和機制1。本文作者利用體視學及生物化學方法對星形膠質細胞瘤中的細胞凋亡、細胞增殖進行觀察，以探討星形膠質細胞瘤中細胞群體的生長狀態，確定腫瘤的發生與細胞增殖、凋亡的相關性。1材料和方法1.1材料提取DN

6、A所用34例新鮮組織，均取自我校附屬同濟醫院19961997年神經外科手術切除腫瘤，-70凍存備用，其中2例經2.5%戊二醛固定，鋨酸染色，常規電鏡包埋制片，Opton EM 10C型透射電鏡觀察。相應手術標本的部分組織，經FAA固定，石蠟包埋，切片厚4 m，HE染色，經病理檢查證實為星形膠質細胞瘤。級星形膠質細胞瘤19例，級間變型星形膠質細胞瘤7例，級多形性膠質母細胞瘤8例。1.2DNA的提取和DNA凝膠電泳取100 mg凍存的新鮮組織，在冰浴條件下用消毒剪刀充分剪碎，置于勻漿器中，注入10倍體積的裂解液和蛋白酶K(終濃度為120 mg.L-1)，55 過夜，DNA按常規酚-氯仿-異丙醇法提

7、取，并用無水乙醇沉淀總量DNA。取樣品DNA 10 l，點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，EB顯色觀察。1.3凋亡細胞形態學觀察及AI、MI的計數根據凋亡細胞的形態學特點，應用光鏡和電鏡觀察凋亡細胞的細胞核、胞漿及細胞器的變化和凋亡小體，并利用10 mm×10 mm的接目測微器在光學顯微鏡下計數，每張切片凋亡細胞分布不均，有明顯的區域性，凋亡細胞計數排除壞死區、壞死周邊及腫瘤附近的正常組織中的凋亡細胞和凋亡小體，凡腫瘤區的凋亡細胞和凋亡小體均參與評估，累計10個高倍視野(40×10倍)的凋亡細胞、凋亡小體、分裂細胞、總的細胞數。1.4統計學方法采用相關系數分析2結果2.1DN

8、A凝膠電泳DNA經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB顯色，紫外光檢測儀檢測。26例標本可見到明顯的DNA梯帶，而7例級星形膠質細胞瘤標本及1例級間變型星形膠質細胞瘤標本未見DNA梯帶。2.2凋亡細胞的光鏡檢查光鏡下觀察的凋亡細胞胞體皺縮，核內染色質呈濃縮的新月形和不規則的串珠狀，伴有強嗜伊紅的胞漿，與腫瘤細胞分開，周邊有明顯的空暈環繞(1)，凋亡小體含有崩解的濃縮的染色質，有強嗜伊紅的胞漿包繞。而腫瘤組織中核分裂象多為病理核分裂象，其染色質分布不均，周邊不整齊(2)，籍此可與凋亡細胞區分。1 凋亡細胞()強嗜伊紅的胞漿,與腫瘤細胞分開,周邊有明顯的空暈環繞,核染色質斷裂成圓形小體.HE×4

9、002 核分裂后期細胞.HE×4002.3凋亡細胞的電鏡檢查電鏡觀察凋亡細胞體積縮小，微絨毛消失，胞核內染色質濃縮，邊集于核膜下，呈帽狀、新月狀，胞漿緊實，細胞器集中，線粒體完整呈正常狀態，凋亡小體內含有完整的細胞器和核碎片(3)。3 凋亡細胞體積縮小,核染色體濃縮,邊集于核膜下,胞漿緊實,細胞器集中.EM×10 0002.4凋亡細胞的計數計數凋亡細胞、凋亡小體、分裂細胞和總的細胞數，得出AI、MI、AI/MI。結果見表1。 表1星形膠質細胞瘤中AI、MI、AI/MI腫瘤分組nAI(%)MI(%)AI/MI級星形膠質細胞瘤190.03(00.08)0.140.21間變型星形

10、膠質細胞瘤70.07(00.11)1.820.04多形性膠質母細胞瘤80.12(00.20)2.10.06r=0.898，P<0.01 3討論腫瘤組織的細胞凋亡是細胞主動死亡過程，在整個過程中發生一系列特殊基因的表達以及生化和形態學改變，對其檢測的手段已經從單純形態學辨認發展到形態與生化的結合，直至目前的形態、生化與分子生物學技術相結合的各種手段2。而形態學判斷是凋亡檢測的經典標準，也是其他各種檢測方法的基礎。測定細胞凋亡的同時必須檢測該細胞群體細胞增殖狀態，對照該細胞群體的增殖指數和凋亡指數，從而確定腫瘤與被檢測細胞群體細胞增殖、凋亡的相關性3。3.1腫瘤的發生與細胞凋亡的相關性在腫瘤

11、組織中，細胞凋亡既是機體抗惡變的防御機制，又是限制腫瘤生長的因素，細胞惡變可以通過細胞凋亡來阻止。腫瘤的發生是細胞增殖的結果，也與自發性凋亡的喪失有關。現在普遍認為細胞凋亡與細胞增殖能力密切相關。惡變細胞被凋亡信號致敏，在適當刺激下此惡變細胞對死亡敏感，從而導致惡變細胞死亡1。細胞發生凋亡，內源性核酸內切酶激活而發生DNA斷裂，斷裂點都有規律地發生在核小體之間，因此出現180200 bp及其倍數的DNA片斷，在凝膠電泳中出現特征性的DNA梯帶，而壞死細胞的DNA斷裂為無特征的雜亂片斷。利用此特征，既可以確定群體細胞的凋亡，又可與細胞壞死區別4，5。本組病變電泳結果顯示26例星形膠質細胞瘤出現特

12、征性的DNA梯帶，8例陰性，此可能與組織中凋亡細胞數少有關。雖然電泳方法缺乏定位特性，在病理形態學中價值不大，但可以確定群體細胞凋亡的存在，以便進一步分析細胞的凋亡。3.2星形膠質細胞瘤良、惡性與細胞群體AI、MI的相關性34例膠質細胞瘤根據WHO分級標準分為級星形膠質細胞瘤、級間變型星形膠質細胞瘤、級多形性膠質母細胞瘤。表1顯示細胞群體AI、MI及AI/MI比率，AI高的腫瘤其MI也高，并且MI一般高于AI。將AI、MI進行相關系數分析，r=0.898，P<0.01，兩者之間正相關，與Kiberu等7對非霍奇金淋巴瘤的AI、MI相關系數分析(r=0.606)的結果基本一致。級星形膠質細

13、胞瘤AI低，AI/MI高，而多形性膠質母細胞瘤AI高，AI/MI低，說明隨著腫瘤惡性程度的增加，細胞凋亡和細胞增殖同時增多，而且惡性腫瘤中細胞增殖遠遠活躍于細胞凋亡。AI/MI比率揭示了細胞凋亡與增殖的關系，本實驗結果與在非霍奇金淋巴瘤中評估AI、AI/MI得出的結論基本一致1。本文計數AI、AI/MI比率，為評價腫瘤細胞動力學及生物學行為提供一個新的檢測手段，作者以10 mm×10 mm接目測微器下40×10倍視野單位面積的總細胞數為基數，既提高了分辨率，又對計數的凋亡細胞數和分裂細胞數進行校正，提高了AI及MI的準確率，減少誤差，有人提出用20×10倍視野下計

14、數，增加總細胞數，但對凋亡細胞的分辨率差，增加了人為因素造成的誤差。總之，星形膠質細胞瘤中控制細胞凋亡和增殖的分子生物學機制是復雜的，細胞惡變可以通過細胞凋亡來阻止。作者利用光學顯微鏡計數AI、AI/MI比率，客觀地評價腫瘤細胞的增殖狀態，從而確定腫瘤的生物學行為，為病理診斷和臨床治療、預后評估提供一個新的科學而有意義的檢測途徑。作者簡介：劉鵬，女，32歲，碩士吳克蘭，女，60歲，教授。研究方向：中樞神經系統疾病的病理診斷和發病機制作者單位：劉鵬（同濟醫科大學病理學教研室，武漢430030）吳克蘭（同濟醫科大學病理學教研室，武漢430030）劉硯（遼寧省錦州醫學院附屬醫院內科，錦州121000

15、）參考文獻1，Schiffer D, Cavalla P, Migheli A et al. Apoptosis and cell proliferation in human neuroepithelial tumors. Neuroscience Letters,1995;195:81842，吳波. 細胞凋亡檢測技術進展及其應用. 臨床與實驗病理學雜志，1997；13(3)：2623，Chandler D, EL-Naggar AK, Brisbag S et al. Apoptosis and expression of the bcl-2 protooncogene in the fetal adult human kidney. Hum Pathol,1994;25:7894，Gerschenson LE, Rotello RJ. Apoptosis: A different type of cell death. FASEB,1992;6:24545，Cummigs MC, Winterford CM, Walker NI. Apoptosis. Am J Surg Pathol,1997;21:886，Majno G, Joris I. Apoptosis, oncosis and necrosis: An