1、中 國 海 洋 大 學(xué) 實(shí) 驗 報 告 姓名：常天易 系年級：海洋生命學(xué)院2012級 專業(yè)：生物科學(xué) 科目：分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗 學(xué)號： 一、實(shí)驗?zāi)康模海?） 、通過對植物葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法（2） 、觀察葉綠體的間接熒光，并了解熒光顯微鏡的使用方法二、實(shí)驗原理顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的黏度有關(guān)。在一定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同，一次增加離心力和離心時間，就能使非均一懸浮液中的顆粒按其大小。密度的先后分批沉降在離心管的底部分批收集，即可獲得各個亞細(xì)胞的組分。葉綠體的分離應(yīng)該在等滲溶液中進(jìn)行

2、，以免滲透壓影響葉綠體，對其造成損傷。在熒光顯微鏡下可以觀察葉綠體的自發(fā)熒光和間接熒光。三、實(shí)驗材料 新鮮菠菜。等滲溶液：0.35mol/L氯化鈉溶液，試劑：0.01%吖啶橙(acridine orange)四、實(shí)驗方法、葉綠體的分離選取新鮮的菠菜葉30.0g，放入150ml的等滲溶液中，在組織搗碎機(jī)中搗碎3min 取6層紗布將溶液過濾于燒杯中，取濾液4ml在1000r/min下離心2min棄去沉淀 將上清液在3000/min中離心5min，棄去上清液，沉淀即是所需的葉綠體將沉淀用等滲溶液懸浮2、菠菜葉手撕片的制備、下表皮因海綿組織較疏松，可以直接手撕下表皮的薄膜在顯微鏡下觀察。、上表皮因柵欄

3、組織較致密，可以用刀片將下表皮刮掉，在顯微鏡下觀察上表皮的細(xì)胞和氣孔。3、菠菜的葉綠體的觀察在普通光學(xué)顯微鏡下，將制得的手撕片放在載玻片的等滲溶液中，游離的葉綠體懸濁液點(diǎn)在在載玻片上，輕輕地蓋上蓋玻片（防止氣泡產(chǎn)生），即可觀察。在熒光顯微鏡下，將游離葉綠體懸濁液的的標(biāo)本放在熒光顯微鏡下，先后用綠光、藍(lán)光對其進(jìn)行照射，在電腦上觀察其產(chǎn)生的自發(fā)熒光。向手撕片的標(biāo)本、游離葉綠體懸濁液的的標(biāo)本中加入1-2滴0.01% 吖啶橙染液，先后用綠光、藍(lán)光對其進(jìn)行照射，在電腦上觀察其產(chǎn)生的間接熒光。五、實(shí)驗結(jié)果氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體圖 1菠菜手撕片的標(biāo)本中，上表皮及其氣孔游離葉綠體保衛(wèi)細(xì)胞表皮細(xì)胞圖 2菠菜手撕片的

4、標(biāo)本中，下表皮及其氣孔氣孔葉肉細(xì)胞游離葉綠體圖 3葉表皮在綠光照射下的間接熒光游離葉綠體表皮細(xì)胞氣孔保衛(wèi)細(xì)胞圖 4葉表皮在藍(lán)光照射下的間接熒光圖 6 游離葉綠體在綠光照射下的間接熒光圖 5游離葉綠體在藍(lán)光照射下的間接熒光 6、 討論1、 本實(shí)驗證明，在1000r/min離心2min，棄去沉淀上清液在3000r/min下離心5min，棄去上清液的差速離心，沉淀含有葉綠體，混有部分細(xì)胞核。在藍(lán)光照射下發(fā)出的間接熒光可見到細(xì)胞核物質(zhì)發(fā)出的綠色熒光。（圖5）2、 在制備菠菜葉手撕片時，由于下表皮上方的海綿組織較為疏松，所以可以較容易地制得下表皮的手撕片；上表皮下方的柵欄組著較為致密，所以可以通過從下表

5、皮輕輕地掛掉下表皮和葉肉的方法來制備上表皮的手撕片。3、 在對上下表皮的對比中可以發(fā)現(xiàn)，上表皮的氣孔比下表皮的氣孔更少，上表皮的細(xì)胞間隙比下表皮的細(xì)胞間隙更狹窄；其原因可能是上防止上表皮的水分蒸發(fā)過于強(qiáng)烈，以保水。4、 菠菜是雙子葉植物，其保衛(wèi)細(xì)胞呈腎形，明顯內(nèi)壁薄，外壁厚，保衛(wèi)細(xì)胞中含有葉綠體，支持淀粉糖變化學(xué)說和蘋果酸生成學(xué)說。5、 在對菠菜手撕片標(biāo)本在綠光照射下發(fā)出的間接熒光進(jìn)行觀察，葉片的背景顏色呈現(xiàn)紅色，葉綠體處紅色最深，可以較為清晰的顯示出葉綠體的位置；同時說明葉片中還有其他物質(zhì)在綠光的照射下發(fā)出紅色的熒光（圖3）。6、 在對菠菜手撕片標(biāo)本在藍(lán)光照射下發(fā)出的間接熒光進(jìn)行觀察，葉片的

6、背景顏色呈現(xiàn)綠色，部分呈現(xiàn)紅色，不能清晰的顯示葉綠體的位置。這可能是由于細(xì)胞中的核物質(zhì)在藍(lán)光的照射下造成了綠色的背景（圖 4）。、在綠光照射下游離葉綠體的自發(fā)熒光呈紅色，觀察到的葉綠體數(shù)目較多（圖3），藍(lán)光照射下葉綠體的自發(fā)熒光也呈紅色，觀察到的葉綠體數(shù)目較少（圖5）。、游離的葉綠體在綠光照射下的間接熒光呈現(xiàn)紅色。、游離的葉綠體在藍(lán)光照射下下的間接熒光呈現(xiàn)紅色，有部分綠色是細(xì)胞核物質(zhì)在藍(lán)光照射下發(fā)出的。顯示的葉綠體數(shù)目比在藍(lán)光照射下的自發(fā)熒光顯示的數(shù)目多。、綜上比較，游離的葉綠體由藍(lán)光照射發(fā)出的間接熒光的顏色強(qiáng)度比手撕片中葉綠體由藍(lán)光照射發(fā)出的間接熒光的顏色強(qiáng)度強(qiáng)，游離的葉綠體由綠光照射發(fā)出的

7、間接熒光的顏色強(qiáng)度和手撕片中葉綠體在由綠光照射發(fā)出的間接熒光的顏色強(qiáng)度差距不大；葉綠體在綠光照射下的熒光顏色強(qiáng)度比同樣標(biāo)本藍(lán)光照射下的熒光顏色強(qiáng)度強(qiáng)；葉綠體在藍(lán)光照射下的間接熒光強(qiáng)度比葉綠體在藍(lán)光照射下的自發(fā)熒光強(qiáng)度強(qiáng)；葉綠體在綠光照射下的間接熒光強(qiáng)度比葉綠體在綠光照射下的自發(fā)熒光強(qiáng)度稍強(qiáng)。七、作業(yè)1. 在熒光顯微鏡下，觀察葉綠體的自發(fā)熒光時，更換濾鏡系統(tǒng)，葉綠體的顏色是否有變化？答：實(shí)驗觀察到，在觀察葉綠體自發(fā)熒光時，在不同的光的照射下，葉綠體的自發(fā)熒光波長沒有明顯的變化，因為葉綠體在吸收相應(yīng)波長的光達(dá)到激發(fā)態(tài)時只會發(fā)射出一定波長的光。綠光為葉綠體的最適激發(fā)波段。在藍(lán)光的照射下，葉綠體的自發(fā)熒光的顏色強(qiáng)度明顯低于在綠光照射下的葉綠體自發(fā)熒光的顏色強(qiáng)度。實(shí)驗中濾鏡的作用是吸收對人眼會造成危害的光線。2. 游離葉綠體和整體細(xì)胞內(nèi)的葉綠體，在熒光顯微鏡下，其顏色和強(qiáng)度有無差異？為什么？答：有。游離葉綠體在藍(lán)光照射下發(fā)出的間接熒光顏色比整體細(xì)胞在藍(lán)光照射下發(fā)出的間接熒光顏色要深，因為游離葉綠體進(jìn)行光合作用積累了大量的胞內(nèi)物質(zhì)其中大多沒有被及時利用，因此其中的糖類等物質(zhì)要高于細(xì)