1、一 馬鈴薯花葉病的表現 1 葉病包括4種病毒:1925年發現的馬鈴薯X病毒(PVX)、1952年發現的馬鈴薯S病毒(PVS)、1932年鑒定的馬鈴薯A病毒(PVA)及1931年記載的馬鈴薯Y病毒(PVY)。（1）馬鈴薯X病毒 (Potato virus X 簡稱PVX)在馬鈴薯上引起輕花葉癥，有時產生斑駁或環斑，病毒粒體線形，長480一580納米，其寄主范圍廣，系統侵染的植物主要是茄科，病毒稀釋限點1000001000000倍，鈍化溫度68一75C，體外存活期l年以上。導致的癥狀不同，通常的癥狀為輕型斑駁花葉，葉片顏色深淺不一，小葉片上葉脈間產生黃色嵌斑，嚴重時還會產生植株頂端壞死、葉片皺縮，

2、植株矮化。通常引起花葉,伴有矮化癥狀,大田可見頂花葉和系統花葉,葉片局部濃綠或葉脈壞死,葉片變窄,葉上部畸形等".（2）馬鈴薯S病毒 (Potato virusS 簡稱PVS)，在馬鈴薯上引起輕度皺縮花葉或不顯癥，多數品種上引起葉脈顏色變深、下陷，葉片粗縮，葉尖下卷，葉色變淺；有的品種感病后產生輕度斑駁、脈帶；有的易感品種在感病后期葉片變成古銅色，嚴重皺縮，葉面產生小的壞死斑病毒粒體線形，長650納米，其寄主范圍較窄，系統侵染的植物僅限于茄科的少數植物，病汁液稀釋限點1一10倍，鈍化溫度55一60C，體外存活期3一4天。目前主要根據在鑒別寄主昆諾黎上引起的癥狀不同,把Pvs分為2個株

3、系,即Pvso(ordinarystrain)和PvsA(AndeanStrain)4."前者在昆諾黎上引起局部壞死斑,后者引起系統斑駁癥狀"這2個株系在馬鈴薯上引起的癥狀也不盡相同,前者單獨侵染通常為隱癥帶毒,后者常常導致葉片青銅色,并伴有壞死斑點"（3)馬鈴薯A病毒 (PotatovirusA簡稱PVA)病毒浸染植株后，葉片扭曲，葉間出現黃色斑駁，后期葉脈下陷，葉邊緣粗縮,在馬鈴薯上引起輕花葉或不顯癥病毒粒體線形，長730納米，其寄主范圍較窄，僅侵染茄科少數植物，病汁液稀釋限點10倍，鈍化溫度4452C，體外存活期12一18小時。PVA單獨浸染常引起花葉或皺葉

4、,有時無癥狀 .馬鈴薯 A 病毒（PVA）一般會在馬鈴薯葉片上引起輕度花葉，在葉脈上或葉脈間會呈現出不規則的淺色斑，暗色部分比健葉顏色深，葉子表面粗糙，葉緣可產生皺褶呈波狀，在有的栽培品種上可表現不同程度的卷曲和皺縮。病株的莖枝向外彎曲，常呈開散狀。(4) 馬鈴薯Y病毒 (potato virus Y 簡稱PVY)，PVY是一種很典型的RNA病毒在馬鈴薯上引起嚴重花葉或壞死斑和壞死條斑，病毒粒體線形，長730納米，該病毒寄主范圍較廣，可侵染茄科多種植物，病汁液稀釋限點100一1000倍，鈍化溫度52一62C，體外存活期12天，這種病毒引起的馬鈴薯病,一般分為馬鈴薯重花葉病、條斑垂葉壞死病、條斑

5、花葉病條斑花葉病、點條斑花葉病.PVY具有PVY0株系(普通株系)、PVYc株系(條痕花樣株系)、PVYN株系(煙草葉脈壞死株系)等多個不同特性的變異株系.依據血清學反應,PVY分成PVY OC血清型和PVYN血清型; PVY粒子為彎曲的線條狀粒子,通常長約700一900nm,直徑11一15nm,大小為730x11nm螺旋對稱,螺距3.4nm,顆粒含有大約5%的核酸和95%的蛋白質"沉降為單一組分,沉降系數約150s在cscl中浮力密度為一3"致死溫度52一55e,體外保毒期2一3d,稀釋終點10一4-10一5二 馬鈴薯病毒檢測技術1 指示植物法1 病毒名稱 接種方式 指示

6、植物及其癥狀（1）PVX 汁液摩擦 (1) 千日紅：接種5-7天后葉片出現紫紅環枯斑 (2)千日紅對馬鈴薯x病毒的反應是接種后在葉片上出現紅 色病斑 (3) 白花刺果曼陀羅：接種10天后系統花葉 (4) 指尖椒：接種10-12天后葉片出現褐壞死斑點，以后系統花葉（2）PVY 汁液摩擦 (1) 枸杞：接種10天后接種葉片出現不清晰的褐色局部病斑 ( 2)馬鈴薯A6：接種5-10天接種葉片出現褐色環狀枯斑，初 侵染呈綠環斑 (3) 洋酸漿對馬鈴薯Y病毒的反應是接種后在葉片上出現小枯斑（3）PVS 汁液摩擦 德伯尼煙：初期明脈，以后系統綠塊斑花葉 （4） PVA 地霉松對馬鈴薯A病毒的反應是在葉片上

7、出現許多小型點狀病斑 2 電子顯微鏡技術3雙抗體夾心酶聯免疫吸附法 在酶聯反應板的每個孔中加入100ul稀釋好的包被液(在每10 mL包被緩沖液中加入35ul待測病毒抗體), 37攝氏溫度育34 h,或室溫 孵育5h,取待測樣品約0. 5 g放入樣品袋中,加入2. 0 mL提取緩沖液,研磨樣品至完全磨碎。將包被好的反應板洗滌后每孔加入100ul樣品液。密封后將其放入4 攝氏溫度冰箱孵育過夜。反應板經洗滌后每孔加入90ul已稀釋的酶標液(每10 mL包被緩沖液中加入35Ll待測病毒對應的酶標抗體), 37攝氏溫度 育34 h,或室溫下5 h洗板后每孔中加入80ul的底物溶液, 30 min左右觀

8、察結果并用酶聯免疫吸附檢測儀讀出數據。二 馬鈴薯花葉病的取樣勻槳法,稱取病葉l克加PB緩沖液(O.IM磷酸緩沖液PH7.0)lml,勻漿,8000轉/分離心10分鐘,取上清即為病毒懸液,病毒懸液再用PB緩沖液分別稀釋成10-1,10-2 .10-5,備用. 馬鈴薯 X 病毒的毒源分離、繁殖和提純用一皺縮花葉癥狀的東農 303 馬鈴薯檀株作為接種體，摩擦接種于 白花 刺果 蔓陀 蘿 (D atura stram onism )，以 排 除 Y 病 毒，然 后 接 種 于 千 日紅G om phrena globosa)T_進行兩次單斑分離 ，再接種于 普 通煙 (N ieotiana tabag

9、urll e'4H um g M iao Y u)上繁 殖 病 毒 ，K hurana 等 的方法 ，稱取冷凍毒 源葉片300 g ，以B eckan O ptima LE 一8OK 型 超速離 心機提 純病 毒 ，用 O2 M 磷酸氫二鈉，0 05 M 檸檬酸三鈉緩沖液(內含 O1二 乙基二硫代氨基 甲酸鈉和 O5巰基乙醇) 勻漿毒源葉 片，用 7 正丁醇 澄清提取液 ，先用聚 乙二 醇 6000 沉 淀一次病毒 ，然后 以 10000d ra in 離心 90 m in 沉淀病毒 ，再以 10- 40 蔗糖密度梯度，28000 rm in 離心90 m in，用260nm 監測 ，

10、分部收集病毒帶 ，然后臺并病毒帶加進一倍緩沖液 ，用 45000 rm in 離心 90 m in 回收病毒。 三 馬鈴薯花葉病病原培養基的制備四 馬鈴薯花葉病病原的理化性質的鑒定 2 血清學檢測對待測樣品進行DAS一ELISA檢測,結果表 明馬鈴薯 PVX 可與PVX抗血清產生明顯的陽性反應。 圖PvX病毒粒體 表 :各標樣血清學反應及粒體形態2 免疫學檢測技術 (.1)雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(DAS一ELISA)DAS一ELISA是:一種傳統的植物檢測技術,在馬鈴薯病毒檢測中有其獨到的應用最早是由clark和AdnlnS1977年提出的,現在被普遍應用于各種植物的病毒檢測"為了

11、加快反應速度,節省時間,白艷菊等在常規DAS一ELISA方法基礎上做了兩方面的改進:第一,由常規ELISA在一塊板上一種酶標記一種抗體改為同塊板上幾種酶對應標記幾種抗體(以PVX PVY PvS ) 第二,DAS.ELISA各種反應均在恒溫搖床中進行,實現了快速同時檢測多種馬鈴薯病毒Ellis等采用雙抗體夾心法進行了PvY的鑒定和PvY血清型地理分布工作國內也廣泛應用雙抗體夾心法檢測PvY并且己將此法應用于脫毒苗的檢測中"宋吉軒等分別用改進DAs一ELISA法和常規DAS一ELISA法對馬鈴薯4種主要病毒PVX!PVY!PVS!PLRV進行檢測,其檢測結果完全一致,且靈敏度也基本相同

12、=-04"結果表明,改進DAs一ELIsA法是一種快速準確可靠的檢測方法,適合種薯生產中大量樣品的多種馬鈴薯病毒的快速檢測"3 電子顯微鏡觀察取與PVX抗血清有陽性反應的馬鈴薯葉片,采用汁液負染法進行電鏡觀察。結果表明病毒粒體均為彎曲的線條狀,大小5l5 X 13nm ,與PVX病毒相符。4在紫外分光燈下剛定OD值 246nm(pvx)為最低,260nm為最高。消光系數OD260/280分別為1.22。 五 馬鈴薯花葉病病原的分子生物學方法1根據NCBI報道的六種馬鈴薯病毒的保守序列設計馬鈴薯X病毒(PVX)!馬鈴薯Y病毒(PVY)!馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)!馬鈴薯M病毒

13、(PVM)!馬鈴薯S病毒(PVS)!馬鈴薯A病毒(PVA)的特異性引物對2馬鈴薯病毒單重RT一pCR檢測的靈敏度測定在馬鈴薯病毒單重靈敏度測定中,:將50一100mg馬鈴薯葉片或莖稈(薯塊可以取幼芽提取RNA)放入研缽中,迅速加入液氮并將樣品研磨至粉狀,研磨充分后把粉末轉移到離心管中,加入500ml裂解液(使用前應按比例加入p一琉基乙醇),溶液和粉末振蕩均勻后將勻漿轉移到CS過濾柱上,12000rpm下離心3min,吸取上清液到另外的離心管中,再加入上清液0.5倍體積的乙醇,混勻合均勻后將溶液和沉淀一起轉移到CR吸附柱中,12000rPm離心lmin,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管

14、"向吸附柱中加入7O0ul去蛋白液RWI,在12000rPm下離心lmin,倒掉廢棄液,將吸附柱放回收集管,然后向吸附柱中加入5O0ul漂洗液RW,在1200OrPm下離心lmin,倒掉廢棄液,重復洗滌一次"洗滌完后將吸附柱在12000rpm下離心2一3min,以去除殘液,讓吸附柱在室溫下放置幾分鐘后,將吸附柱放入新的離心管中,向吸附柱的膜中央加入50一80ulddHZO,再在室溫下放置幾分鐘,在1200Orpm下離心Zmin,得到提純的總RNA"提取的RNA溶液,于一20e保存"制備1%的瓊脂糖凝膠,電泳檢測各病毒RNA的完整性,在120伏恒壓條件下電泳30分鐘以上,在凝膠成像儀上成像檢測"先將六種病毒的RNA模板分別進行反轉錄,將得到的cDNA用核酸蛋白分析儀測定其含量,經測定,PVM的CDNA含量為710ng/ul,PVS的CDNA含量為63Ong/ul,PVX的CDNA含量為69