1、噬菌體展示載體的構建中國藥科大學JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2002,33(6):529,532529噬菌體展示載體的構建吳國球 , 沈子龍 .( 中國藥科大學生物技術中心, 南京 210009)摘要目的構建適宜噬菌體展示的載體系統. 方法利用 pCOMB3的 LacZ 強啟動子 ,Pelb 引導序列 , 包膜蛋白 ?基因 , 用 NHeI XbaI 雙酶切 , 切除一個克隆位點 ; 同時設計一對引物 , 用PET一 28(a) 作模板擴增 550bp 片段 , 插入 XhoI SpcI 位點之間 , 擴增質粒后用限制性內切酶 ,PCR,DNA測

2、序等方法作鑒定 . 結果切除了 272bpNHeIXbaI 片段 , 插入片段后酶切鑒定顯示:XhoI,SpcI單酶切 ,XbaI,NheI無酶切 ; 所構質粒用 Xhol+SpcI 雙酶切及 PCR擴增均可見 550bp 片段 ; 測序結果正確 . 結論成功構建了一種高拷貝 , 穩定 , 多用途 , 易于操作的噬菌體展示載體 .關鍵詞噬菌體展示 ; 構建 ; 載體中圖分類號 :Q78 文獻標識碼 :A 文章編號 :1000 5048(2002)06 052904 噬菌體展示文庫在新藥開發領域, 尤其在全人源化單克隆抗體方面為擴展生物多樣性提供了強大的研究工具 】. 它能容納超過上百萬個單個分

3、子的克隆 , 因此又稱全套基因庫 , 可以通過受體與配體 , 抗原與抗體相結合的特性, 從中篩選出目的基因克隆 , 使目的基因能在很短的時間內( 數周 ) 高效克隆 , 篩選和表達 2.文庫的大小是決定生物多樣性的關鍵 . 因此構建一種高拷貝 , 穩定 , 多用途 , 易 于操作的載體具有十分重要的意義 .l 材料和方法1.1 材料pCOMBs質粒 ,XL1 一 blue 菌株 ( 東南大學基礎醫 學院張建瓊博士惠贈 ),PET 一 28(a) 質粒 ,JM109 菌 株 ( 本實驗室保存 ), 限制性內切酶 NheI,XbaI, SacI,SpeI,XhoI(Mm),T4 連接酶 , 瓊脂糖

4、 ,EDTA, DNA回收試劑盒等 ( 上海生工 ),LB,SOC 按常規方 法配制 ,PCR儀(AmpGene4800),電泳儀 ( 北京六一 儀器廠 ).引物 :P1:5'-GGGCCAACTCTAGTATGGCCC一3' 下劃線為 XhoI 酶切位點P2:5'-GG 壘! 壘!CTAACCAGCAC'ITCAGTGGGAA一3' 下劃線為 SpcI 酶切位點 Ck連寶生物工程公司合成 ) 1.2方法收稿日期 20020417 通訊作者 Tel:025 的擴增含pCOMB3的 XL1一 blue 接種于四環素 (50mg/L), 氨芐青 (100mg

5、/L) 雙抗平 板,37? 過夜培養 , 挑單個菌落 , 接種 l0ml 的 LB 液體增菌培養液 ,37C6h, 搖至 ODeoo為 0.36,按常 規方法抽提質粒 : 按每毫升菌液 l00lI液 (50mmol/LGlucose,25retool/LTrisHC1,l0retool/L EDTA),200l?液(0.24mmol/LNaOHl00l, 5SDSl001),l50l?液(3mmol/LK.Ac,2.5 mmol/LHAc)混勻 ,12000r/min5min, 吸取上清液 , 等體積酚 : 氯仿抽提一次 , 上清液加兩倍體積的無水乙醇 ,4? 放置10min,12000r/m

6、in離心 5min,棄上清 , 沉淀揮干后 , 加無菌水 20l, 一 20.C 保存備 用 .片段切除及剩余片段的連接pCOMBsl0l, 加 l0 ×buffer4l,去離子水34l,NheI,XbaI各 1.0 l,37?酶切 2h, 回收片段 ,20l水溶 . 取 5l 加 l0 ×ligationll,去離子水 3.5l,T4連接酶 0.5l,16? 連 接過夜 .感受態細胞制備及轉化XL1 一 blue 單菌落接種于 100mlLB(含氨芐青100mg/L),37? 搖至 OD600為 0.4,8000r/min2min收集菌液 , 按每毫升菌液加0.5mol/

7、LCaCI2lOOgd, 冰上放置 30min,8000r/min20min, 棄上清 , 沉淀用相同濃度 CaC1z懸浮菌 液,lOOp1 分裝 , 加 l0 甘油 , 一70?保存 . 取連接液 5l, 加入 lOOpl 感受態細胞 , 冰上放置 30min,42?530 中國藥科大學 33 卷熱激 90s, 加入預熱 SOClml,37?搖 45min, 涂布于 四環素 (50mg/L), 氨芐青 (100mg/L) 雙抗平板 , 同 時設陰 , 陽性對照 ,37? 過夜 , 隨機挑選單菌落擴大 培養 , 抽提質粒 , 分別用 NheI,XbaI,SacI,SpeI, 酶切 檢查 ,0.

8、8 瓊脂糖 l00v/50mA 電泳 40rain,EB 染 色 , 觀察結果 . 陽性質粒命名為 Pa.插入片段的制備插入片段的擴增PET一 28(a) 質粒抽提后 , 取 ll加l0 ×buffer3l,P131(50pmo1),P231(50pmo1),Taq 酶 0.5l,dNTPll, 加 D2o至 30l, 加一滴礦物油 ,94? 變性 5min 后執行 94? 變性 lmin,45? 退火 lmin,72? 延伸 lmin 循環 程序 ,25 個循環后 72?延伸 10min, 同時設陰 , 陽性對照 .PCR產物用 1.2 瓊脂糖電泳檢查 , 切下 550bp 條帶

9、. 每 l00mg 瓊脂糖加400lBinding buffer,50?放置2min, 轉移至離心柱,8000r/min lmin,棄廢液后加Washsolution450ml,8000r/minlrain,棄廢液 , 重復一次 ,12000r/min,開蓋離心 lmin, 在柱中央加20lD2O,12000r/min2rain,一20?保存 .酶切取 酶切鑒定陽性質粒及550bpPCR回收片段各 l01 分別加 l0 ×buffer2 l,D207l,SpeIll,37?酶切4h,65?20min滅活 ; 補加 10×buffer2.3l,XhoIll37?繼續酶切 4h

10、,1.5 瓊脂糖電泳 , 按方法回收相應片段 .連接及轉化取回收片段各4l加T4liga sell,l0×T4ligationll,16C連接過夜 , 全量轉化 XL1 一 Blue 感受態細胞 ,42? 熱激后涂布于氨芐 , 四環素雙抗平板 ,37? 過夜 . 挑單菌落接種于雙 抗 LB,37.C6h, 抽提質粒 ,1.5 瓊脂糖電泳檢查及酶切位點檢查取質粒 ll, 加引物Pl,P2 各 3l,Taq 酶 0.5l,dNTPll,l0×buffer2l,補加 DzO至 20l,l滴礦物油 ,按程 序 25 個循環 ,1.2 瓊脂糖電泳觀察結果 . 取 PCR 陽性質粒 5

11、l, 加入 l0 ×bufferll,D2O3l,SpeIll,37?酶切4h,65?20min滅活;補加l0 ×buffer 1.1l,XhoIll37?繼續酶切4h,1.5瓊脂糖電泳 ,EB 染色 , 觀察結果 . 陽性質粒命名為載體測序測序引物為5 一TTACTCGCTGCCCAACCAG一3', 引物距 XhoI 位點尚有 20 個堿基 , 采用 ABIPRISM377DNA2 結果1) 第二個克隆位點的切除 pCOMB3用 NheI+XbaI 雙酶切 , 可見 272bp 條帶 , 切除上述片段后 , 將剩余大片段回收自連后轉化并抽提質粒, 分別用NheI

12、,XbaI,Spel,XhoI酶切檢查 , 結果顯示 :Xbal,NheI 無酶切 ,SpeI,hoI可見單酶切條帶 , 酶切位點正確(圖 1).3800bp一272bp一I,2:Nhel,Xbalseparatelyanalysis;3,4:Spel,Xholseparatelyanalysis;5:Nhel+Xbalanalysis;6:pCOMB3;7:kphageDNA/HindI+IKbDNALder.Fig1.Restrictionenzymeanalysisofplasmid 2)片段插入 PET一 28(a) 作模板PCR擴增后 ,可見 550bp 條帶 , 回收片段后與相同酶

13、切的Pa 載體連接 , 轉化后篩選陽性質粒 ,1.5 瓊脂糖電泳條帶出現在 Pa 之后 . 隨機挑選 l0 個單菌落進行 PCR檢查 , 其中 9 個出現 550bp 條帶 , 陽性率 90( 圖 2).SpeI+XhoI 雙酶切檢查 , 可見 550bp 及 3800bp 條帶 ( 圖 3).Pa 質粒送生工測序 , 結果與預期序列一致 ( 測序結果略 ). 1,2,4,6,7,8,9:PCRproduct;3:negativeresult;5kbMaerFig2.PCRanalysisoftransformants6 期吳國球等 : 噬菌體展示載體的構建53l3800bp一550bp 一1

14、:XphageDNA/HindI/EcoR1;2:PCRproduct;3:pCOMB3;4:pa;5:Nhel+Xbalanalysisofpositiveplasmid(Pa+);6:PCRanalysisof positiveplasmid(Pa) Fig3.Restrictionenzymeanalysisofplasmid3 討論噬菌體表面呈現技術 (Phagedisplagtechnology)使制備全人源化單可隆抗體成為可能.1989 年 Huse 等口首次用噬菌體建立了小鼠抗體片段的抗體文庫 , 隨后又有單鏈 Fv(ScFv)E,Fab 片段以及雙功能抗體文庫的報道 . 用于抗

15、體表面呈現的噬菌體載體是體現這一技術的關鍵. 目前使用的載體包 括 Lerner 實驗室以 pBluescrip為背景構建了 pCBAK8,pCOMB3,pCOMB8,Chang,用 PUC和 PGC1構建 pTACP,Winter 實驗室以 PUC119構建的 pCANTAB等載體 ,pCOMB3是許多實驗室廣泛采 用的載體 , 它拷貝數高 (>200 拷貝 / 細胞 ), 容易分 離 , 帶有 Ap 抗性基因用于篩選 , 目的基因表達在 ? 基因上游 , 用于融合及呈現 ; 含有 LacZ 強啟動子 , Pelb 引導序列 , 包膜蛋白 Ill 基因 . 重鏈基因克隆位 點

16、XhoI SpeI, 輕鏈基因克隆位點Xball SacI. 但我們在使用過程中發現 , 克隆基因頻繁發生缺失 , 其原 因可能因為此載體含有兩個克隆位點, 分別用于克隆重鏈和輕鏈基因 ,每個位點含有 LacZ 啟動子 , 核 酶結合位點及 Pelb 前導序列 . 限制酶分析顯示 , 缺失發生在兩個克隆位點之間 , 此區域包含兩個 8lbp 的重復序列 , 即 24105bp 和10371118bp 之間 , 質 粒在線性化變性后第一個克隆位點的重復序列與第 2 個克隆位點的重復序列發生退火 , 從而導制基 因缺失 . 通過切除 272bpNHeIXbal 片段 , 即切除第 2 個克隆位點及

17、其 81bp 的重復序列 , 消除了相應的 缺失 .NheI(G.CTAGA)和 XbaI(TCTAGA)是同尾酶 , 因此用雙酶切除 272bp 片段后 , 剩余片段可通過 T4 連結酶自連 .另外 , 在操作過程中 , 我們還發現由于Spel XhoI 之間僅相差 40bp, 因此在雙酶切后 , 由于片段大小無法用普通瓊脂糖電泳檢查酶切是否完全, 是單酶切還是雙酶切 , 操作極為不便 , 因此插入 550bp片段 , 可大大簡化酶切消化 , 克隆及電泳分離等DNA操作步驟 . 由于切除了第 2 個克隆位點 , 因此構建的載體宜用于單鏈抗體的克隆與表達.本載體是絲狀噬菌體的突變株, 作為克隆

18、載體 , 噬菌體在轉染細胞后能夠自我復制并翻譯出目的蛋白 , 在用輔助噬菌體如 VCSM13,M13K07共同感染后 , 噬菌體能自我組裝 , 形成新的噬菌體 .Ill基因是噬菌體的包膜蛋白基因, 編碼 406 個氨基酸 , 其C端 (P198 一 $406) 鑲嵌在噬菌體外殼上 ,N 端 (1 一P918)伸出噬菌體的表面特異性地吸附在雄性 E. coli 的性菌毛上 , 當用目的基因代替 N端時 , 伸出部分帶有目的蛋白 , 但失去了浸染雄性曰 .coli 的能力 . 因此只有用輔助噬菌體超感染提供野生型 ?基因分子 , 才能組裝成具有另一輪浸染活力的噬菌體顆粒 , 不用輔助噬菌體 , 就

19、成了與表達質粒完全相同的表達載體 , 因此稱雙相表達載體 .參考文獻1CourtneyBC,WilliamsKC,SchlagerJJ,eta/.Aphagedisplayvectorwithimprovedstability.applieabilityandeaseofmanipulationJ.Gene,1995,185:139一 l4O.2ScottJK.DiscoveringpeptideligandsusingepitopelibrariesJ.TrendsBiocm8ci,1992,17:386390.3HuseWD,SastryL,lversonSA,eta/.Generatio

20、nofalargecombinatoriallibraryoftheimmunoglobulinrepertoireinphagelambdaEJ'.Sconce,1989,246 275.4McCaffertyJ,GriffithsAD,WinterG,eta/.Phageantibodies:filamentousphagedisplayingantibodyvariabledomainsJ.Nature,l990,348:552554.5HoogenboomHR.Multi subunitproteinsonthesurfaceoffilamentousphage:methodo

21、logiesfordisplayingantibody(Fab)heavyandlightchainsEJ.Nuc/e/cAck/sRes,1991,19:41334137.63MeGuinnessBT.PhagediabodyrepertoiresforelectionoflargenumbersofbispecificantibodyfragmentsJ.Nat.Botec/md,1996,14: 兒 49 一 ll54.7CarlosF,BarbasI,AngrayK,eta/.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurfaces

22、:thegeneIsiteJ.ProcNailAcadU8A,1991.88:7978 7982.532 中國藥科大學 33 卷ConstructionofVectorforPhageDisplayWUGuo-Qiu.SHENZi-LongB/otechno/ogyCenterofChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,ChinaABSTRACTAIMToconstructethevectorforphagedisplay.METHODSByremovingaNheI-XbaIcloningsite,pCOMB3wasremainedtobeal

23、acZstrongpromoter,aPelBleadsequenceandacoatproteingene?.Inthemeanwhile,550bpfragmentwhichwasamplifiedbydesignedtwoprimersandusingtempletofPET 一 28(a)wasinsertedintothesitesbetweenXholandSpelI.Thephagemidwasidentifiedbythemethodsofrestrictiveenzymeanalysis,PCRandDNAsequencingaftermultiplied.RESULTSA272bpfragmentwasdeletedbyNheI XbaI;RestrictiveenzymeanalysisshowedthattheplasmidwascutbymeansofsinglesiteofeitherXhoIorSpeI;therewerenositesofXbaIorNheI;550bpfragmentwasamplifiedbyPCRusingtempletofconstructedplasmid;DNAseq