1、HIV RNA定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程SOP文件1、范圍 本章規(guī)定了測(cè)定HIV病毒載量常用方法的實(shí)驗(yàn)室條件、方法、結(jié)果判定以及應(yīng)用,適用于血漿中HIV病毒載量的測(cè)定。 2 、規(guī)范性引用文件 Guidelines for the Use of Antiretroviral HIV-Infected Adults and Adolescents MMWR Recommendations and Reports1、范圍 本章規(guī)定了測(cè)定HIV病毒載量常用方法的實(shí)驗(yàn)室條件、方法、結(jié)果判定以及應(yīng)用,適用于血漿中HIV病毒載量的測(cè)定。 2 、規(guī)范性引用文件 Guidelines for the Use of A

2、ntiretroviral HIV-Infected Adults and Adolescents MMWR Recommendations and Reports April 24, 1998/47(RR-5); 42-82. Chiron Product insert (Quantiplex HIV-RNA), L6170 rev 5.0, June 1994 Roche AMPLICOR HIV MONITOR TEST Procedure Manual. Fractions of HIV-1 Seropositive Persons by Two Nucleic Acid Amplif

3、ication Assays, AIDS. Research and Human Retrovirus 1993; (9):259-265. 3、實(shí)驗(yàn)室條件 3.1實(shí)驗(yàn)室功能分區(qū) 3.1.1實(shí)驗(yàn)室原則上應(yīng)分為4個(gè)獨(dú)立工作區(qū) 試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，并設(shè)在不同房間。前兩區(qū)為擴(kuò)增前區(qū)，后兩區(qū)為擴(kuò)增后區(qū)。各區(qū)的功能是： 3.1.1.1 試劑準(zhǔn)備區(qū)：擴(kuò)增試劑的配制、分裝和保存。 3.1.1.2 樣品處理區(qū)：樣品登記、分裝；核酸提取、保存和加樣。 3.1.1.3 擴(kuò)增區(qū)：核酸擴(kuò)增。 3.1.1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定、結(jié)果分析、登記及報(bào)告。 3.1.2 擴(kuò)增前區(qū)與擴(kuò)增

4、后區(qū)應(yīng)嚴(yán)格分開，須使用不同的房間，兩區(qū)之間最好有一定的間隔。 3.1.3 使用商品化試劑盒可在樣品處理區(qū)進(jìn)行少量試劑配制。 3.1.4 在滿足下列操作和清潔處理要求的前提下樣品處理區(qū)和試劑準(zhǔn)備區(qū)可設(shè)在同一房間內(nèi)： 3.1.4.1 在生物安全柜內(nèi)操作。 3.1.4.2 每個(gè)實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)組分別使用各自的試劑及耗材。 3.1.4.3 盛放污染材料的器皿密封并一次性使用。 3.1.4.4 用有效的方法對(duì)操作區(qū)域和共享器具在實(shí)驗(yàn)前后進(jìn)行清潔及消毒。推薦的程序是： （1）實(shí)驗(yàn)前將次氯酸鈉溶液或70%乙醇涂布于操作臺(tái)或器具表面，兩分鐘后用紙巾擦除。 （2）移入盛放污染材料的器皿、所需的試劑、耗材和樣品，進(jìn)

5、行試驗(yàn)。 （3）一個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域在同一時(shí)間段只進(jìn)行一種實(shí)驗(yàn)。 （4）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，移出個(gè)人專用材料至個(gè)人專用區(qū)域保管；封好污染材料盛放器皿并移至污物袋；移出共享器具至專門區(qū)域保管；將次氯酸鈉溶液或70%乙醇涂布于操作臺(tái)或器具表面，兩分鐘后用紙巾擦除；打開紫外燈照射至少15min。 3.1.5 各區(qū)域的儀器、設(shè)備、器具、工作服和試劑應(yīng)為該區(qū)專用，不得交叉使用。 3.2 人員 進(jìn)行HIV核酸檢測(cè)的人員須具有艾滋病實(shí)驗(yàn)室的上崗資格，并接受過省級(jí)以上艾滋病實(shí)驗(yàn)室安全及實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)培訓(xùn)。 3.3 設(shè)施和設(shè)備 3.3.1 根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目配備相應(yīng)的設(shè)施和設(shè)備。 3.3.2 各區(qū)域的設(shè)施和設(shè)備應(yīng)為區(qū)域性專用，開展特定

6、試驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)要求在相應(yīng)區(qū)域放置專用設(shè)備。以下是各區(qū)域應(yīng)配備的設(shè)備： 3.3.2.1 試劑準(zhǔn)備區(qū)：冰箱、潔凈工作臺(tái)、離心機(jī)、加樣器、振蕩器、廢棄物容器。 3.3.2.2 樣品處理區(qū)：冰箱、生物安全柜、離心機(jī)、加樣器、振蕩器、恒溫水浴、上下水設(shè)備、廢棄物容器。 3.3.2.3 擴(kuò)增區(qū)：核酸擴(kuò)增設(shè)備、冰箱、離心機(jī)、加樣器、廢棄物容器。 3.3.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：冰箱、離心機(jī)、加樣器、電泳儀、振蕩器、恒溫水浴、上下水設(shè)備、廢棄物容器、核酸污染物處理設(shè)備等。 3.3.2.5 配備-80冰箱。 3.3.3 各區(qū)域應(yīng)備有工作人員專用的工作服或一次性工作服、帽子和鞋套，必要時(shí)配備防護(hù)眼鏡和/或口罩。 4

7、 、方法和試劑 4.1 方法 常用的HIV RNA定量測(cè)定方法有逆轉(zhuǎn)錄PCR試驗(yàn)（RT-PCR）、核酸序列擴(kuò)增試驗(yàn)（NASBA）、分支DNA雜交試驗(yàn)（bDNA）。 4.2 試劑 HIV RNA定量檢測(cè)包括bDNA、RT-PCR、NASBA試劑。 5 、實(shí)驗(yàn)室管理 HIV核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定嚴(yán)格的管理制度，工作人員必須充分了解各項(xiàng)規(guī)定并嚴(yán)格遵照?qǐng)?zhí)行。 5.1 生物安全 必須符合艾滋病實(shí)驗(yàn)室的通用生物安全要求。 5.2 嚴(yán)格執(zhí)行分區(qū)制度 5.2.1 按照要求嚴(yán)格進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分區(qū)。 5.2.2 各區(qū)域只用于特定的操作，不得從事其它工作。 5.3 儀器和材料的專用制度 儀器、設(shè)備、材料、設(shè)施均應(yīng)按工作區(qū)

8、域進(jìn)行標(biāo)識(shí)，不得交叉混用。 5.4 單向流向制度 5.4.1 實(shí)驗(yàn)材料,包括：樣品及其擴(kuò)增產(chǎn)物、實(shí)驗(yàn)器材（容器、板架、個(gè)人護(hù)具）、試劑、記錄紙、筆、清潔材料等,只能從擴(kuò)增前區(qū)流向擴(kuò)增后區(qū)，即從試劑準(zhǔn)備區(qū)樣品處理區(qū)擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆向流動(dòng)。 5.4.2 實(shí)驗(yàn)室的氣流也應(yīng)從擴(kuò)增前區(qū)流向擴(kuò)增后區(qū)，不得逆向流動(dòng)。 5.4.3 盡量減少人員由擴(kuò)增后區(qū)返回?cái)U(kuò)增前區(qū)的頻度。 5.5 廢棄物處理制度 5.5.1 所有廢棄物應(yīng)按照HIV污染物品處理。 5.5.2 由專人按特定程序和方法進(jìn)行清潔和消毒。 5.6 質(zhì)量控制和評(píng)價(jià) 5.6.1 制訂質(zhì)量保證計(jì)劃，包括內(nèi)部質(zhì)量控制和參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的程序。 5

9、.6.2 建立內(nèi)部質(zhì)量控制制度，每次需加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。 5.6.3 定期接受室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。 6 、HIV核酸定量檢測(cè)的意義 6.1 輔助診斷 在一般情況下，HIV抗體檢測(cè)足以對(duì)HIV感染與否做出正確診斷，但在特殊情況下，單純抗體檢測(cè)不足以完成明確的判定，如出現(xiàn)某些非典型的抗體反應(yīng)形式，特別是不確定反應(yīng)時(shí)，RNA的測(cè)定可提供非常有用的證據(jù)。雖然單純使用RNA測(cè)定不能完全確定感染與否，但當(dāng)RNA測(cè)定出現(xiàn)較高拷貝數(shù)的陽(yáng)性結(jié)果時(shí)（3，000c/ml），感染發(fā)生的可能性非常大。 需要指出的是，每一種RNA定量系統(tǒng)都有其最低檢測(cè)限，即可以測(cè)出的最低拷貝數(shù)，通常在50100c/ml以上，RNA定量檢

10、測(cè)時(shí)未測(cè)出不等于樣品中不含有病毒RNA。另外，許多AIDS病人/HIV感染者在接受抗病毒治療后其病毒載量可降至非常低的水平，還有少數(shù)HIV感染者在感染后長(zhǎng)期處于病毒水平非常低的狀態(tài)，進(jìn)行RNA測(cè)定時(shí)往往測(cè)不出來。因此，使用此指標(biāo)應(yīng)綜合其它檢測(cè)數(shù)據(jù)和樣品背景情況進(jìn)行綜合判斷。 6.2 早期診斷 在HIV感染的窗口期無(wú)法使用抗體檢測(cè)進(jìn)行診斷。而在感染早期，在抗原峰出現(xiàn)前后通常出現(xiàn)一個(gè)病毒載量的高峰，此高峰通常高于發(fā)病時(shí)的血漿病毒水平，并且有證據(jù)表明這個(gè)時(shí)期的病毒具有很高的感染能力。這個(gè)高峰在免疫系統(tǒng)產(chǎn)生反應(yīng)后，尤其是在細(xì)胞免疫出現(xiàn)后開始下降。因此早期病毒RNA測(cè)定具有特殊的意義。該方法也可用于HI

11、V感染孕婦所生嬰兒的早期輔助診斷。 目前國(guó)際上正在嘗試使用這種檢測(cè)對(duì)采供血樣品進(jìn)行多個(gè)樣品混合后的RNA檢測(cè)以減少窗口期危險(xiǎn)（降低“殘余危險(xiǎn)度”）。 6.3 病程監(jiān)控 根據(jù)HIV感染發(fā)生后病毒載量具有一定的變化規(guī)律，并且這種變化與疾病的進(jìn)程有著密切的相關(guān)性。因此定期進(jìn)行病毒載量的檢測(cè)有助于確定疾病發(fā)展的階段，以確定相應(yīng)的治療方案。 通常在HIV感染后無(wú)癥狀期內(nèi)發(fā)生的感染或其它臨床癥狀很難與AIDS發(fā)病時(shí)的癥狀區(qū)別，為確定一個(gè)剛發(fā)生的癥狀是否與HIV的感染有關(guān)，醫(yī)生往往需要觀察病人的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，病毒載量就是一個(gè)非常重要的指標(biāo)。 6.4 指導(dǎo)治療方案及療效判定 臨床實(shí)踐證明，并非在任何情況下HIV感染者都應(yīng)該進(jìn)行抗病毒治療。這不單是經(jīng)濟(jì)上的原因，更重要的是由于抗病毒藥物的副作用和療效原因。通常在病毒載量達(dá)到一定水平后（如35，00050，000c/ml）抗病毒治療才具有良好的效果。 在進(jìn)行治療后，通過病毒水平的檢測(cè)才能確定治療是否有效，通常在治療前后病毒水平降低0.5 log以上才被認(rèn)為臨床有效。 6.5 預(yù)測(cè)疾病進(jìn)程 HIV感染后疾病進(jìn)程與病毒載量的關(guān)系十分密切，觀察HIV感染者病毒RNA水平可大致預(yù)測(cè)其發(fā)病的可能。病毒載量與6年發(fā)病率的關(guān)系為：30，000c/ml時(shí)則為80%