1、    TaqMan聚合酶鏈反應技術檢測結核 分支桿菌DNA及其臨床應用        【摘要】目的探討TaqMan聚合酶鏈反應(TaqMan-PCR)技術在肺結核診斷中的價值。方法對168例活動性肺結核、57例肺癌患者的痰和外周血及34例健康對照外周血，同時應用TaqMan-PCR、PCR檢測，并與痰涂片法、BACTEC法及改良羅氏培養法結果進行比較。結果TaqMan-PCR檢測痰和外周血總的陽性率分別為53.0%和61.3%，顯著高于PCR、痰涂片法、BACTE

2、C法及改良羅氏培養法(P<0.05)。TaqMan-PCR檢測痰和外周血特異性分別為96.5%和94.7%，與PCR檢測痰和外周血的特異性為93%相比，差異無顯著性(P>0.05)。在105例痰涂片陰性及痰培養陰性肺結核患者中TaqMan-PCR檢測外周血的陽性率達45.7%。結論TaqMan-PCR具有較高的敏感性和特異性，對肺結核尤其痰涂片陰性及痰培養陰性肺結核的診斷有價值。【關鍵詞】結核；分支桿菌，結核；聚合酶鏈反應 Detcetion of DNA extracted from Mycobacterium tuberculosis by TaqMan-PCR techniq

3、ue and its clinical applicationCHEN Xiaoyou*, WANG Hongping, JIN Yusheng,et al.Beijing Tuberculosis & Thoracic Tumour Institute, Beijing 101149, China【Abstract】ObjectiveTo evaluate the clinical diagnostic value of TaqMan-PCR technique in the diagnosis of active pulmonary tuberculosis. MethodsThe

4、 specimens of sputum and peripheral blood from 168 patients with active pulmonary tuberculosis, 57 patients with lung cancer and the specimens of peripheral blood from 34 healthy individuals were detected by TaqMan-PCR, PCR. The specimens of sputum were also detected by smear, culture with BACTEC an

5、d Lowenstein-Jensen for comparison. ResultsThe positive rates of sputum and peripheral blood detected by TaqMan-PCR were 53.0% and 61.3%, respectively, significantly higher than those of PCR, smear, culture with BACTEC and Lowenstein-Jensen (P<0.05). There was no significant difference between Ta

6、qMan-PCR and PCR for specificity (P>0.05). Of 105 specimens of peripheral blood from patients with smear-negative and culture-negative pulmonary tuberculosis, 48 specimens of peripheral blood detected by TaqMan-PCR were positive. The positive rate was 45.7%. ConclusionsTaqMan-PCR method showed hi

7、gher sensitivity and specificity. It is an useful tool for diagnosis of pulmonary tuberculosis, particularly smear-negative and culture-negative pulmonary tuberculosis. 【Key words】Tuberculosis；Mycobacterium tuberculosis；Polymerase chain reaction當今，結核病依然十分猖獗，全球約有1/3人口感染結核分支桿菌，每年有8001 000萬新發病例及300萬人死于

8、該病1-3。控制傳染源和盡早發現新發病例顯得尤為重要。目前，結核病的實驗室診斷方法不外乎結核分支桿菌的痰涂片法和改良羅氏培養法，然而，涂片的陽性率低、培養費時已成人們的共識。1985年Mullis創建了聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)技術，1989年Hance等4首先將該技術應用于檢測分支桿菌,1990年我國引進該項技術，從而開辟了以PCR為代表的分子生物學技術檢測結核分支桿菌階段。PCR技術靈敏度高，可檢測1100 fg純化結核分支桿菌DNA(約相當于120個結核分支桿菌菌體的DNA量)5。TaqMan聚合酶鏈反應技術(TaqMan-PCR)是一種

9、最新的熒光定量基因擴增技術之一。我們采用的是PE 7700熒光定量PCR儀對臨床標本進行研究。熒光定量基因分析法的原理：大多數Taq酶不僅有53 DNA聚合酶活性，能在引物的引導下延伸DNA鏈；而且還有53外切酶活性，可以在延伸的過程中實現鏈的替換，并將被替換的單鏈切斷。熒光定量基因分析法就是巧妙地運用了Taq酶的這兩種酶活性而發展起來的。在擴增反應體系中加入一條與待擴增的目的片段互補熒光標記探針，長約20 bp，該探針5端標記一報告熒光基團(reporter, R)，3端標記一淬滅熒光基團(quencher, Q)，當探針保持完整時，其Q基團抑制了R基團的熒光信號，該檢測系統將不能檢測到報告

10、熒光的信號；一旦探針被切割，R基團游離，Q基團的抑制作用消失，該檢測系統便可檢測到R基團的熒光信號。PCR反應前，探針與模板互補結合，PCR反應開始后，隨著產物鏈的延伸，Taq酶沿著DNA模板移動到熒光標記探針結合位置，發揮53外切酶活性，將熒光探針切斷，使報告熒光基團游離，Q基團的抑制作用消失，該檢測系統便檢測到報告熒光信號，熒光信號的強弱與PCR產物的數量呈正比。因此通過檢測到的R基團熒光信號的強弱可間接推測PCR產物的數量。材料與方法一、材料1.全血：選取1998年11月1999年8月間我院住院患者，包括168例活動性肺結核和57例肺癌患者。34例健康獻血者，則由北京市通州區輸血中心提供

11、。用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝采血3 ml。活動性肺結核病例均經X線、痰抗酸染色涂片、痰BACTEC、痰改良羅氏培養及(或)臨床抗結核治療有效而確診6，肺癌病例均經細胞學及(或)活體組織病理檢查而確診且痰結核分支桿菌檢查均為陰性，胸部X線檢查無活動性結核病變。2.痰液：以上活動性肺結核及肺癌病例均于漱口后留取晨痰。3.主要儀器及試劑：ABI PRISM 7700 熒光定量PCR儀: 美國PE公司生產；熒光探針和擴增引物：以結核分支桿菌復合物特有的IS6110插入序列為基礎(擴增片段長度為163 bp)，由上海生物工程公司合成；Taq酶購于上海Promega公司。4.結核分支桿菌:有H37

12、Rv、H37Ra、牛分支桿菌、卡介苗共4株；非結核分支桿菌：有堪薩斯分支桿菌、海分支桿菌、猿猴分支桿菌、戈登分支桿菌、不產色分支桿菌、土地分支桿菌、胞內分支桿菌、鳥分支桿菌、草分支桿菌、母牛分支桿菌、恥垢分支桿菌、淺黃分支桿菌、偶然分支桿菌共13株；非分支桿菌：有布氏桿菌、大腸桿菌、肺炎球菌、百日咳桿菌各1株。結核分支桿菌各菌株為我所保存株；非結核分支桿菌及非分支桿菌各菌株由中國藥品生物制品檢定所提供。二、方法1.標本的前處理及DNA制備：(1)全血：將抗凝血混勻離心，2 000 r/min，20 min，將其有核細胞層轉移至含有5 ml紅細胞裂解液(S-ACK)的離心管中，冰上放置20 mi

13、n，離心，2 000 r/min，去上清，磷酸緩沖液(PBS, pH 7.2)洗滌兩次，離心，去上清， 有核細胞中的DNA提取按相關文獻提供的方法進行7，編號備用。(2)痰液：取晨痰液0.5 ml，加入4% NaOH充分振蕩后室溫放置30 min，離心，5 000 r/min，去上清，1×TE(pH 8.0)洗滌兩次，離心，去上清，加1×TE(pH 8.0)200 l，煮沸10 min，取上清，編號備用。2.PCR擴增體系及條件：見表1。表1TaqMan-PCR及PCR擴增條件項目TaqMan-PCRPCR擴增體系:10×PCR緩沖液 5 l 5 l 25 mmo

14、l/L MgCl2 5 l5 l 10 mmol/L dNTPs 1 l 1 l 20 mol/L 上引物1 l 1 l 20 mol/L 下引物 1 l 1 l 10 mmol/L二硫蘇糖醇 2 l 2 l 二甲基亞砜2.5 l 2.5 l 10 mmol/L探針 1 l 0 l Taq DNA 酶 2 l 2 l 模板 4 l 4 l 雙蒸水 25.5 l 26.5 l 總計 50 l 50 l擴增條件：94 2 min94 45 s,60 1.5 min 40個循環72 7 min3擴增結果判斷：（1）PCR產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳-EB染色-紫外線下肉眼觀察163 bp DNA片段，

15、出現DNA帶者為陽性，未見DNA帶者為陰性。(2)TaqMan-PCR反應結束后，使用Sequence Detector V1.6.3軟件進行數據分析，處理每次的陽性標準中的報告熒光信號數值，建立標準曲線，從而計算出檢測樣品中的擴增片段的拷貝數，拷貝數大于0者為陽性，否則為陰性。4.本實驗采用雙盲法。 結果一、TaqMan-PCR和PCR反應的特異性選取非結核分支桿菌13株及布氏桿菌、大腸桿菌、肺炎球菌、百日咳桿菌各1株，TaqMan-PCR和PCR的擴增結果皆為陰性；結核分支桿菌(H37Rv和H37Ra)、牛分支桿菌、卡介苗標準株各1株, TaqMan-PCR和PCR擴增結果皆為陽性，以上檢

16、測的細菌數均為103個。說明該引物是針對結核分支桿菌復合群特異性的引物。表2TaqMan-PCR和PCR的靈敏度檢測方法100 ng 10 ng 1 ng100 pg 10 pg 1 pg100 fg10 fg 1 fgPCR + + + + - - -TaqMan-PCR + + + + + + +-注：“+”表示陽性，“-”表示陰性 二、TaqMan-PCR和PCR反應的靈敏度純化的結核分支桿菌染色體基因組DNA經751型紫外分光光度計定量，從每l 100 ng開始，10倍稀釋至1 fg，并對結核分支桿菌菌體進行10倍稀釋，分別進行TaqMan-PCR和PCR檢測3次。結果顯示PCR的檢測

17、靈敏度達1 pg DNA和20個菌體/ml，而TaqMan-PCR的檢測靈敏度達10 fg DNA和15個菌體/ml。TaqMan-PCR的檢測靈敏度要比PCR高10100倍。見表2。 三、168例活動性肺結核病例的檢測結果168例活動性肺結核患者中，檢測外周血的總的陽性率TaqMan-PCR和 PCR分別為61.3%(103/168)和43.5%(73/168)，前者高于后者，兩者經統計學處理差異有顯著性(P<0.01)；檢測痰的總陽性率TaqMan-PCR為53.0%(89/168)，PCR為48.2%(81/168)、痰涂片法為33.3%(56/168)、BACTEC法為36.3%

18、(53/146)、改良羅氏培養法為21.8%(31/142)，經統計學處理TaqMan-PCR和PCR之間差異無顯著性(P>0.05)，兩種PCR與痰涂片法、BACTEC及改良羅氏培養法之間差異有顯著性(P<0.05)；TaqMan-PCR檢測外周血總的陽性率為61.3%(103/168)，高于其對痰檢測的陽性率53.0%(89/168)， 兩者經統計學處理差異有顯著性(P<0.05)。見表3。表3168例活動性肺結核病例的檢測結果檢測方法總 例數痰外周血陽性例數陽性率(%)陽性例數陽性率(%)TaqMan-PCR 168 89 53.0 103 61.3PCR 168 81

19、 48.2 73 43.5痰涂片法 168 56 33.3BACTEC法146 53 36.3改良羅氏培養法142 31 21.8注：BACTEC法和改良羅氏培養法由于部分病例在培養過程中出現污染而無結果 四、菌陽和菌陰肺結核的檢測結果63例痰涂片陽性及(或)培養陽性(簡稱菌陽)病例中，檢測痰的陽性率TaqMan-PCR為93.7%(59/63)，PCR為87.3%(55/63)，經統計學處理兩組之間差異無顯著性(P>0.05)；檢測外周血的陽性率TaqMan-PCR為87.3%(55/63)，明顯高于PCR的74.6%(47/63)(P<0.05)。105例痰涂片陰性及培養陰性(

20、簡稱菌陰)病例中，檢測痰的陽性率TaqMan-PCR為28.6%(30/105)，PCR為24.8%(26/105)，兩組間差異無顯著性(P>0.05)；檢測血的陽性率TaqMan-PCR為45.7%(48/105)，顯著高于PCR的24.8%(26/105)(P<0.01)。詳細結果見表4。表4菌陽和菌陰肺結核病例兩種PCR擴增結果組別例數TaqMan-PCRPCR陽性例數陽性率(%)陽性例數陽性率(%)菌陽痰 63 59 93.7 55 87.3*血 63 55 87.3 47 74.6* 菌陰 痰 105 30 28.6 26 24.8*血 105 48 45.7 26 24

21、.8*注：與TaqMan-PCR檢測的陽性率比較，*P<0.05,*P>0.05 五、57例肺癌及34名健康對照的檢測結果57例肺癌病例中，痰檢測結果PCR有4例陽性，其中有2例 TaqMan-PCR檢測結果亦呈陽性，假陽性率分別為7.0%和3.5%，兩者差異無顯著性(P>0.05)；血檢測結果PCR有4例陽性，其中有3例TaqMan-PCR檢測結果亦呈陽性，假陽性率分別為7.0%和5.3%，兩者差異亦無顯著性(P>0.05)。34名健康對照血的TaqMan-PCR和PCR結果均為表557例肺癌及34名健康對照的兩種PCR結果組別例 數TaqMan-PCRPCR陽性例數

22、陽性率(%)陽性例數陽性率(%)肺癌組 痰 57 23.5 4 7.0*血 57 35.3 4 7.0*健康對照組 血 34 0 00 0注：與TaqMan-PCR檢測的陽性率比較，*P>0.05陰性。故TaqMan-PCR和PCR檢測痰的特異性分別為96.5%和92.9%，檢測外周血的特異性分別為96.7%和95.6%。特異性之間的差異無顯著性(P>0.05)。詳細結果見表5。 討論應用PCR檢測痰8-10及外周血11-13中結核分支桿菌DNA，國內外已有不少報道，其陽性率43.75%95%不等。本研究結果為：PCR痰和血的陽性率分別為48.2%和43.5%，與文獻報道基本一致。

23、TaqMan-PCR痰和血的陽性率分別為53.0%和61.3%，與國內應用AmpliSensor-PCR檢測痰和血的結果54.7%和60.5%也基本一致14,15。這兩項PCR技術在大規模檢測臨床標本方面，國外尚未見相關報道，國內未見TaqMan-PCR在臨床標本中檢測的報道。Rolfs等16研究認為，應用PCR技術檢測外周血結核分支桿菌DNA，對于無明顯免疫功能異常所致結核分支桿菌播散入血的病例的臨床意義不大。我們的研究發現TaqMan-PCR及PCR的陽性率分別達到61.3%和43.5%，而臨床上卻無明顯結核分支桿菌播散的表現。對此有作者認為是由于患者在感染結核分支桿菌后體內白細胞介素1(

24、interleukin-1)的分泌和白細胞介素2受體(interleukin-2 receptors) 的表達增加，而使分支桿菌的產物大量入血所致17,18。因此，對外周血應用TaqMan-PCR技術檢測結核分支桿菌DNA，我們的研究結果提示有一定的臨床意義。我們同時對菌陽和菌陰肺結核的痰和血的兩種PCR結果進行了分析，發現：TaqMan-PCR對菌陽肺結核的痰和血陽性率達93.7%和87.3%，而PCR對菌陽肺結核的痰和血陽性率為87.3%和74.6%；在菌陰肺結核中TaqMan-PCR 和PCR檢測痰和血陽性率分別為28.6%和45.7%、24.8%和24.8%。由此可以看出TaqMan-

25、PCR的敏感性要優于PCR。尤其在菌陰肺結核中TaqMan-PCR對外周血的敏感性達到45.7%，提示為菌陰肺結核一種有效的輔助檢查手段。在菌陽肺結核中，TaqMan-PCR及PCR仍出現陰性結果，經重復實驗仍為陰性結果。其原因我們分析有如下可能性：由于擴增體系中存在抑制子(inhibitors)導致假陰性；不除外這些病例中，部分病例所感染的結核分支桿菌存在IS6110序列的缺失19；可能這些病例中的部分病例系非結核分支桿菌感染20。TaqMan-PCR是應用ABI PRISM 7700 熒光定量PCR儀，該系統是一密閉的DNA擴增檢測系統，在將擴增體系所需各物質加樣完畢后，即可進行擴增和檢測

26、，擴增產物的檢測是通過系統對熒光探針5端游離的R基團熒光強弱的分析來判斷擴增產物的量，這樣可以避免PCR結果通過瓊脂糖凝膠電泳-溴化乙錠染色-紫外線下肉眼判斷結果帶來的主觀性，同時由于整個擴增檢測是在一密閉體系中進行，減少了擴增體系本身以及其對實驗室環境的污染；同時進行TaqMan-PCR時只有該對引物之間的模板序列得到擴增方可檢測出，從檢測上去除了非特異擴增的產物，從而減少了假陽性和假陰性結果。而AmpliSensor-PCR法，經過兩次PCR擴增14，無疑增加了對實驗室的污染，同時降低了檢測方法的特異性。在57例肺癌病例中兩種PCR均出現幾例陽性結果，我們分析可能性如下：假陽性結果。腫瘤組

27、織壞死時，其內的隱性病灶中分支桿菌被釋放所致21。不能除外由于肺癌患者均有不同程度的免疫力低下，合并結核分支桿菌感染，靶菌量少，常規方法不易檢出。在對假陽性和假陰性的控制方面，我們主要采取如下措施：加樣、擴增及檢測均在不同的房間中進行，避免交叉污染的發生。每次的擴增均設陽性對照和陰性對照。PCR的檢測結果經兩人同時判斷，減少單人判斷結果的主觀性。本研究是在雙盲下進行，總結時對于擴增結果與病例的臨床資料不符時，一律進行重復檢測，重復檢測的結果前后均無差異。我們還對10例菌陽肺結核患者的療效進行了動態觀察，發現其中8例經正規抗結核治療2月的患者，X線表現肺內病灶明顯吸收好轉，痰涂片及培養轉陰，普通

28、PCR仍為陽性，而TaqMan-PCR顯示其痰和血中的DNA量明顯下降。另2例抗結核治療2月后，X線及痰菌無明顯好轉，PCR 及TaqMan-PCR仍為陽性，且TaqMan-PCR所顯示的DNA量無明顯變化。說明該方法可作為療效判斷的一項有用的指標。由于病例較少，尚不能進行統計分析，有待今后進一步研究。TaqMan-PCR是將PCR從定性檢測發展到定量檢測，這無疑擴大了它的應用范圍，也提高了其應用價值。文中報道的TaqMan方法具有良好的敏感性和特異性，故其在結核病的輔助診斷、預后觀察及療效評價方面必將有重要的應用前景。 作者單位：陳效友（101149 北京市結核病胸部腫瘤研究所）高

29、薇薇（101149 北京市結核病胸部腫瘤研究所）張樹才（101149 北京市結核病胸部腫瘤研究所）馬?（101149 北京市結核病胸部腫瘤研究所）王洪平（中國醫學科學院腫瘤研究所）金玉生（中國醫學科學院腫瘤研究所）張偉（中國醫學科學院腫瘤研究所）參考文獻1，Dolin PJ, Raviglione MC, Kochi A. Global tuberculosis incidence and mortality during 1990-2000. Bull World Health Organ, 1994,72:213-220. 2，Sudre P, Ten-Dam G, Kochi A. Tu

30、berculosis: a global overview of the situation today. Bull World Health Organ, 1992,70:149-159. 3，Raviglione MC, Snide DE, Kochi A. Global epidemiology of tuberculosis-Morbidity and mortality of a worldwide epidemic. JAMA, 1995,273:220-226.4，Hance AJ, Grandchamp B, Levy-Frebault V,et al. Detection a

31、nd identification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA. Mol Microbiol, 1989,3:843-849. 5，Patel RJ, Fries JWU, Piessens WF, et al. Sequence analysis and amplification by PCR of a cloned DNA fragment for identification of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol,1990,28:513-518. 6

32、，GB 15987-1995.傳染性肺結核診斷標準及處理原則.7，張吉旺，彭曉，朱俊芳. 肺結核患者外周血白細胞中結核分支桿菌DNA的檢測.中華醫學檢驗雜志，1996，19:173-175. 8，陳良璽，宋世云，趙秀菊，等. 痰結核桿菌DNA的聚合酶鏈反應檢測及應用.中華結核和呼吸雜志,1995,18:232.9，Bennedsen J, Thomsen VO, Pfyffer GE, et al. Utility of PCR in diagnosis of pulmonary tuberculosis. J Clin Microbiol, 1996, 34:1407-1411.10，Noo

33、rdhoek GT, Kaan JA, Mulder S, et al. Routine application of the polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. J Clin Pathol, 1995,48:810-814. 11，Ahmed N, Mohanty AK, Mukhopadhyay U, et al. PCR-based rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in blood f

34、rom immunocompetent patients with pulmonary tuberculosis. J Clin Microbiol, 1998,36:3094-3095.12，Condos R, McClune A, Rom WN, et al. Peripheral-blood-base PCR assay to identify patients with active pulmonary tuberculosis. Lancet,1996,347:1082-1085.13，鮑小歐,唐少華,鄭金香, 等. 聚合酶鏈反應檢測肺結核患者外周血單個核細胞中結核分支桿菌DNA的臨床價值.中華實用內科雜志,1998,18:223-224.14，譚耀駒，李一耕，譚守勇，等. AmpliSensor-聚合酶鏈反應技術檢測結核分支桿菌及其臨床應用.中華結核和呼吸雜志