1、基于納米操縱的生物信息原位獲取基于納米操縱的生物信息原位獲取胡胡 鈞鈞 中國科學院上海應用物理研究所中國科學院上海應用物理研究所上海交通大學上海交通大學2003年月.杭州背景背景目標和研究內容目標和研究內容已有基礎已有基礎研究背景納米尺度生物信息獲取納米尺度生物信息獲取 隨著生物學研究的不斷發展和深入，越來越需要得到單個細胞、單個分子內部納米尺度原位的生物信息，如基因的時空表達,蛋白質折疊等。 生物體系往往是由多樣化的分子組成的復雜體系，這種多樣化的組成發生在微觀層次，從微米一直延續到納米尺度。研究背景 局限于單個基因的分析 通常不能進行定性研究(如突變) 分辨率不夠Nature Mol.Ce

2、ll Bio. 2003,4:605-612Nuclear speckles傳統的原位生化染色技術（immunohistochemistry & in-situ hybridization ）僅可以獲得局域的生化信息,在納米尺度分析上具有相當大的局限電子顯微技術 空間分辨率足夠 但染色方法有限 只能夠用于成像大鼠肝巨噬細胞Fc受體膠體金染色 復旦大學醫學院研究背景Pick up one interested individual from the mixture by micro-manipulation for conventional bio-analysis研究背景研究背景LCM

3、（激光獲取微切割）（激光獲取微切割） 使得從復雜生物體系中獲取小個單位進行分析成為可能，但分辨率受限（針尖獲取納米切割）（針尖獲取納米切割）將納米操縱技術和高靈敏的生化分析技術結合起來，微納米操縱的精度決定空間分辨率，而生化分析的靈敏度決定信息的獲取靈敏度 microdissectionnanodissection研究背景D. Eigler,1990 原子、分子的納米操縱技術是納米科技的核心技術之一納米操縱技術是納米科技的核心技術之一研究背景研究背景 不同于非生物體系的單分子操縱技不同于非生物體系的單分子操縱技術，由于術，由于DNADNA可以被擴增到宏觀量，可以被

4、擴增到宏觀量，所以可以進行隨后的信息分析所以可以進行隨后的信息分析 我們在對單個生物分子的納米操縱我們在對單個生物分子的納米操縱方方面發展了獨創的技術，并取得方方面發展了獨創的技術，并取得了若干關鍵性進展。了若干關鍵性進展。 進一步開展對當前生物分子的納米進一步開展對當前生物分子的納米操縱技術原位獲取生物信息是非常操縱技術原位獲取生物信息是非常必要的必要的, ,也是完全可能的。也是完全可能的。Jun Hu et al, Nano Letters (2002)研究目標研究目標 我們旨在建立一種基于納米操縱的生我們旨在建立一種基于納米操縱的生物樣品分離、擴增和分析技術物樣品分離、擴增和分析技術,

5、,以此在納以此在納米尺度獲取生物信息。米尺度獲取生物信息。(這里所謂的生物信息，主要是指與生物學功能相關的一些信息，比如是什么蛋白分子、或的序列信息等) 主要研究內容主要研究內容 分子的精確納米操縱技術；分子的精確納米操縱技術； 納米操縱獲得的單個納米操縱獲得的單個DNADNA模板的模板的擴增；擴增； 一種新型的納米測序方法研究一種新型的納米測序方法研究 Molecular combingSingle molecule PCRNano-cutting of interested regionPicking-upSequence analysisStretching Single DNA mol

6、eculesDNAsubstrateeTransfer DNA to vialAFM Tip基于納米操縱在單分子水平上獲取生物信息基于納米操縱在單分子水平上獲取生物信息Series of techniques has to be developedDNA alignmentPrecisely nano-manipulating (cutting, sweeping, folding, picking-up, dipping, )Single molecule PCRAlignment of DNA strand與宏觀世界不同，針尖與宏觀世界不同，針尖與單個分子或原子的相與單個分子或原子的相互作

7、用力主要是互作用力主要是 van der waals 力力？Its difficult to pick up DNA in control with a single AFM tip單分子單分子1kbpNano-dissection and isolation of single DNA fragments in order by AFM tipAmplification by single molecule PCR 1231231kbpSequencing in orderA Strategy for Ordered Sequencing擬重點解決的科學問題或關鍵技術擬重點解決的科學問題或關

8、鍵技術 對對DNADNA片段快速地切割和提取的單分子操縱技術片段快速地切割和提取的單分子操縱技術用用AFMAFM針尖對針尖對DNADNA單分子切割和分離涉及到針尖與樣單分子切割和分離涉及到針尖與樣品、樣品與表面之間復雜的相互作用，目前還沒有關于用品、樣品與表面之間復雜的相互作用，目前還沒有關于用AFMAFM針尖連續切隔和分離過程的報道。針尖連續切隔和分離過程的報道。 單分子單分子PCRPCR擴增技術擴增技術物理方法（切割和拾取）是否會損傷物理方法（切割和拾取）是否會損傷DNADNA模板進而影模板進而影響響PCRPCR擴增的效率是一個要認真考慮的問題；另外，如何擴增的效率是一個要認真考慮的問題；

9、另外，如何實現單分子實現單分子DNADNA為模板的為模板的PCRPCR擴增的較高效率也是很關鍵的擴增的較高效率也是很關鍵的問題。問題。已有基礎已有基礎 “單分子探測與操縱實驗室單分子探測與操縱實驗室”自年代初自年代初長期從事長期從事AFMAFM及其生物學應用研究。年開始及其生物學應用研究。年開始分子的微納米操縱研究。分子的微納米操縱研究。負責人負責人 在在AFMAFM方法學研究上有自己的特點和方法學研究上有自己的特點和優勢優勢( (曾經在曾經在ScienceScience上發表文章并有相應國際專上發表文章并有相應國際專利利), ), 在生物大分子的操縱研究上最近已經實現了在生物大分子的操縱研究

10、上最近已經實現了DNADNA分子的納米圖形構造。分子的納米圖形構造。DNA的拉直與單分子成像的拉直與單分子成像20umx20um DNA的單分子操縱的單分子操縱(切割與拾取切割與拾取)APS云母云母AFM針針尖尖切割力切割力 108牛頓牛頓DNA分子分子“D”, “N”, “A” and “50”formed by DNA molecule itselfBy Jun Hu, Yi Zhang, Xingfei Zhou et al謹以此紀念謹以此紀念DNADNA雙螺旋結構發現雙螺旋結構發現5050周年周年360nmx360nm350nmx350nmdeMarker 108 107 106 10

11、5 104 103 102 10 1單分子單分子PCRPCR稀釋單拷貝booster PCR 結果目前達到4050的成功率切割片斷booster PCR 結果目前達到30的成功率 以pBR322為模板， 利用Pfu 或 Taq 結合booster PCR(Ruano et al., 1989)和touch-down PCR (Don, RH et al. 1991)進行單分子PCR擴增， booster一期擴增20個循環， touch-down二期擴增40個循環，結果如圖。AFM images of human liqual squamous cancer cells(By Xinhui Li

12、 et al, 2002)ultra-thin section of human tissue (15umx15um)ultra-thin section of cultured cell (16umx16um) nucleolusnuclear membrane10umx10um亞細胞水平的切割和操縱亞細胞水平的切割和操縱10umx10um主要研究設備主要研究設備 美國進口的多功能納米美國進口的多功能納米顯微鏡系統（顯微鏡系統（$450k)$450k) 自行研制和改造的分子自行研制和改造的分子操縱設備操縱設備 謝謝 謝！謝！單分子單分子PCRPCR產物錯誤率分析產物錯誤率分析王國華王國華1

13、1 呂軍鴻呂軍鴻1 1 雷曉玲雷曉玲1 1 李海闊李海闊2 2李民乾李民乾1 1陳潤生陳潤生3 3方海平方海平1 1胡鈞胡鈞1,2,1,2,* *1 1中國科學院上海原子核研究所納米生物醫藥研究室，上海中國科學院上海原子核研究所納米生物醫藥研究室，上海 2018002018002 2 上海交通大學上海交通大學Bio-XBio-X生命科學研究中心，上海生命科學研究中心，上海 2000302000303 3 中國科學院北京生物物理研究所分子生物學研究中心，北京中國科學院北京生物物理研究所分子生物學研究中心，北京 100101100101摘要摘要 堿基錯配致使堿基錯配致使PCRPCR擴增產物中存在突

14、變序列。大量模擴增產物中存在突變序列。大量模板板PCRPCR擴增時突變序列所占的比例較低，對隨后進行的擴增時突變序列所占的比例較低，對隨后進行的PCRPCR產產物分析影響不大，但當對微量甚至單個模板物分析影響不大，但當對微量甚至單個模板DNADNA擴增時，情況擴增時，情況則完全不同。單分子則完全不同。單分子PCRPCR產物錯誤率的分析表明，根據實驗目產物錯誤率的分析表明，根據實驗目的和條件選擇忠實性不同的聚合酶是十分必要的。的和條件選擇忠實性不同的聚合酶是十分必要的。Efficient Isothermal Amplification of Single DNA Molecules Stanl

15、ey Tabor and Charles Richardson Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology Harvard Medical School, Boston, MA 02115 We are developing DNA polymerases for use in DNA sequencing and amplification applications. We will describe our progress in developing a very efficient isothermal a

16、mplification system that is based on the replication machinery of bacteriophage T7. This system is capable of amplifying single DNA molecules, increasing the amount of DNA more than a trillion-fold in a 30 min reaction. Amplification is nonspecific. The template can be circular (e.g. plasmid or BAC

17、DNA) or linear (e.g. genomic DNA). The reaction requires no exogenous primers, using the inherent priming activity of the T7 primase. 1. The preparation of plasmid and BAC DNA templates for DNA sequencing. 2. The whole genome amplification of rare DNAs, such as hard-to-culture microorganisms and pur

18、ified chromosomes. 3. An extremely sensitive and rapid assay to determine the total amount of DNA in a sample, with a linear range of over 13 orders of magnitude. 4. The sequencing of haplotypes by the amplification of DNA from single chromosomes. http:/www.mwg-（激光獲取（激光獲取微切割）微切割）microdissection（針尖（針尖獲取納米切割）獲取納米切割）nanodissection原子力顯微鏡原子力顯微鏡AFM針尖Isolatin