1、生態修復對水體微生物的作用原位生態修復技術是利用沉水植物在養殖塘中的控藻增氧效應，對養殖塘中氮、磷等營養物質的吸收同化作用，并應用魚、草、蟹、蝦、貝等構建水域生態系統，完善食物鏈網，同時提供天然飼料和水生動物棲息地，改善養殖塘環境；結合異位生態處理塘、養殖工藝特點進一步削減養殖污水排放，同時從水產養殖健康生態系統角度分析,發揮水域生態系統功能，形成生態化健康養殖模式1-2。而浮游細菌是水生態系統的分解者和小型濾食性動物的餌料，在湖泊生態系統的物質循環和能量流動中具有重要的作用，水質的優劣、水體生態狀況的改變都會對細菌群落的組成產生影響3。此外，水產養殖系統內細菌在物質循環、病害發生與否及水產養

2、殖對象的生長、營養和免疫方面都產生重要作用，與水產養殖系統有關的微生物群落結構研究也有報道，但對于系統微生物狀況的持續變化以及養殖菌劑對微生物系統影響的報道不多4-7隨著分子生物學方法的發展，以基因檢測為基礎的微生物檢測方法在群落結構的動態監測中具有快速、便捷的優點，變性梯度凝膠電泳（DGGE）是目前應用較為廣泛的微生物群落結構分子生物學檢驗方法之一。筆者除了采用傳統法研究微生物數量變化之外，還采用DGGE技術對在養殖區內微生物群落結構的變化開展了較深入的研究，旨在為陸域養殖系統的生物修復提供理論基礎。1材料與方法1.1材料實驗基地位于江蘇無錫市郊胡城鎮龍延村直湖港岸邊。由于水產養殖主要收獲季

3、節在610月，于2009年和2010年的6月、8月、10月3個月在無錫直湖港陸域水產養殖區內采集水樣，養殖區包括進水口、蟹塘1號、蟹塘2號、蟹苗塘、魚塘1號、魚塘2號、魚苗塘及甲魚塘8個點（圖1）。1.2方法1.2.1環境細菌的檢測和樣品總DNA的提取采用平板培養法測定異養細菌數量，用0.2m的聚碳酸酯膜過濾200mL水樣富集水中的細菌，采用申能博采的環境樣品DNA提取試劑盒進行水樣細菌總DNA的提取，具體操作方法參見說明書。1.2.2PCR-DGGE擴增根據參考文獻10,采用上海英駿公司合成的引物序列P338fGC：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG

4、CACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3n518r：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3S用于擴增細菌16SrDNA的V3區段，片段長度為236bpo擴增總體系為50L：模板DNA40-80ng；1Ommo1/L4xdNTPs1.5pL,5U/|iLTaq酶IrL,20pmo1/rL引物各1.5PL,1Ox擴增緩沖液（含Mg2+）5PL,ddII20補足至5OpLoPCR擴增條件：94團預變性5min；9401min,55回退火30s,72團3min,35個循環；72回延伸10min。反應產物直接用于變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析。1.2.3PCR-DGGE凝

5、膠電泳及結果處理DGGE凝膠電泳團所用膠濃度為8%（丙烯酰胺團雙丙烯酰胺=37.501,體積比），細菌page膠變性梯度55%70%,真核生物變性梯度30%50%,用IxTAE作為電泳緩沖液。每孔上樣量50rL。在60團，150V電泳300min后浪化乙錠染色，紫外凝膠成像觀察。通過QuantityOne軟件將DGGE圖譜照片轉化成數字信號，運用MSVP軟件對DGGE指紋圖譜的多樣性和相似性數據進行計算，用SPSS軟件進行主成份分析（PCA分析）。多樣性和相似性的計算方法分別采用香儂威納（Shannon-Wie-ner）多樣性指數和索倫森相似性系數（Sorensen'sCoeffici

6、ent）表示。2結果與分析2.1細菌數量變化從異樣細菌變化情況（圖2）可知，養殖區內的異樣細菌數量變化波動較大，特別是2個魚塘的細菌數量波動可達10倍以上。從圖3也可看出，采用綜合治理技術的蟹塘1號及蟹塘2號的微生物數量明顯下降，分別從2009年的6500個/mL及11000個/mL下降到2010年的1500個/mL和2000個/mL,水質凈化效果明顯，證明綜合治理技術確有效果。在其他養殖塘內，魚塘的細菌數量一直較高，最高17000個/mL,兩年的平均值也都在10000個/mL上下波動，這可能與養殖密度較高有關，相對魚苗塘和甲魚塘細菌數量變化較小，平均值都在5000個/mL左右。統計數據亦表明

7、，2010年的微生物數量總體低于2009年同期，這可能與養殖方式的改進以及太湖整體水質變好有關。2.2水樣細菌的16SrDNA多態性采用DGGE分析PCR產物，均得到若干分離的條帶（圖4）。每個月的電泳圖譜條帶一直在變化，而且每個圖譜中共有條帶并不多見，因此，在不同的養殖系統內，微生物的變化非常明顯，很難找到共有的微生物的存在。盡管8個養殖池水是相通的，但每個池內的小生態系統對微生物的影響較大，導致這一變化的出現。2.3細菌的Shannon-Wiener多樣性指數由圖5可見，8個樣點的香農威納指數都在2.0以上，多樣性較好，進水、蟹塘以及魚塘2號的多樣性指數變化稍大，可能與生態系統不太穩定有關，而魚苗塘、甲魚塘的多樣性指數較為穩定，聯