1、蛋白不表達：常見原因及分析根據自己體會和蛋白版的既往精華帖子，總結了沒有發現蛋白質表達的原因，或者蛋白質不表達的原因，歡迎大家拍磚。1. 載體構建錯誤。 這個屢見不鮮，很多克隆新人經常弄錯讀碼框。比如 Qiagen 的 pQE 系列載體，其克隆位點常有一兩個堿基的區別；另外有些酶產生粘端有些酶產生平端，這些都容易導致讀碼框錯誤，從而表達不出來。2. 宿主菌選擇不當。 不同的宿主菌其基因型是不一樣的。 有些經過特殊修飾的載體，或者特殊用途的載體，或者有特殊啟動子的載體，必須選擇合適的宿主菌進行表達。因此，當你的蛋白沒有表達出來時，可以考慮更換宿主菌。見下圖3. 密碼子的使用頻率低。 有些基因其本

2、身含有許多稀有密碼子， 尤其是起始密碼之后的 15 個堿基之內的稀有密碼子， 對蛋白表達有著很重要的影響。優化密碼子對原核表達似乎效果很好，對真核表達系統未見得有很好的效果。曾經有某人在畢赤酵母表達某蛋白兩年未果，試圖將密碼子優化進行表達，結果還是沒有表達。一氣之下將該優化的基因序列克隆到原核表達載體，表達量居然出奇地高！這是一個辛酸的笑話，但是一個真實的故事。但是有一點我可以有很大把握的說：對于真核表達，密碼子優化只能起錦上添花的作用（確認有表達，以此來提高表達量），而不能雪中送炭（沒有表達出來，通過密碼子優化極有可能不奏效）。4 、質粒不穩定或者質粒丟失。 pET 系統通常比較穩定。但是你

3、選用帶氨芐青霉素抗性的載體時， 也許有可能產生 -lactamase 降解了抗生素，使質粒丟失。還有一種情況是表達重組的毒素蛋白，對宿主細胞也有毒性，造成質粒丟失。這種情況多見于真核表達系統。5 、蛋白酶將蛋白降解了。這種情況常由重組蛋白本身的N- 或C-端序列引起的。當蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或Tyr這些氨基酸時，容易遭受蛋白酶降解，此即N- 末端規則。 N- 端是 Met 時，大腸桿菌可以悄悄地把這個Met 偷走，特別是Met 后緊跟著一個帶小側鏈的氨基酸時。C- 末端存在非極性氨基酸時，也容易導致蛋白被降解。C 末端最后 5 個氨基酸是極性的或者帶電荷

4、的，則不易被降解。6 、二級翻譯起始位點。這種情況見于你的序列里正好含有和核糖體結合位點完全一致的序列。那就怪不得人家了，核糖體會很高興地找到這個位點，然后開始翻譯，致使你的蛋白被截短，在電泳時看不到預期大小的片段。7 、SD 序列。 這個不陌生吧？考研時老師喜歡出名詞解釋，也難怪人家老是拿這個出題 -SD 序列和起始密碼子序列（ 80% 是 AUG ，也有GUG 的）之間的距離，對蛋白表達的效率也有著非常重要的影響。SD 序列本身的組成對翻譯效率也有影響。有時為了減少包涵體的產生，還特別對SD序列進行修飾呢！8 、mRNA 的二級結構。在克隆之前，你得看看你的序列里是否有和核糖體結合位點和

5、/ 或翻譯起始位點互補的序列。如然，你最好進行同義密碼子替換。否則由此形成的 mRNA 二級結構，會讓翻譯嘎然而止的。9 、意外終止。這種情況見于PCR 擴增序列時，會和你開個不大不小的玩笑。比如它會將序列中間TAC 突變為 TAA ，讓你的蛋白翻譯剎車。所以在進行表達之前，一定要進行測序，避免這種情況的發生。10 、轉錄終止子。轉錄終止子的存在可以促進蛋白表達；但是缺少時就會造成 “通讀 ”，沒完沒了地讀下去。這在 pET 系統里不成問題，因為它在靶基因的相反方向有個選擇性的標記基因。如果你的靶基因正好和這個標記基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有個轉錄終止子。如果沒有的話，它們會競

6、爭得天昏地暗，搶著生成 mRNA 和蛋白質。11 、mRNA 的不穩定性。 靶基因的 mRNA 常聚集于細胞內。但是大腸菌的 mRNA 及其不穩定。如果在 mRNA 的 5'- 非翻譯區和 3-rho 非依賴性終止子處插入穩定結構序列，可以促進 mRNA 的穩定性。尤其是 5' 末端要是有個不帶突出的發夾結構，能讓 mRNA 在胞漿內無生命之虞。12 、檢測方法的可行性。有時候，蛋白的確表達了，只是表達量特別低，或者和雜帶靠得特別近， 致使你錯誤地以為蛋白沒有表達。 這時候，你可千萬別忘記了生物學實驗的兩大黃金準則：對照和重復。說到對照，有很多層意思。 最基本的意思是， 要設立空載體對照。 在真核系統表達的蛋白，常常量特別低。 因此你不要老是想著 WB 和 SDS-PAGE 去檢測。這時候， 你必須多看文獻， 另辟蹊徑， 從文獻中找找看這個蛋白有米有很特別的性質-比如說如果它具有酶活性，那簡直就是便宜你了。還比如說，某些蛋白具有異樣性質，比如說流感病毒的HA ，你拿表達的不同梯度稀釋的蛋白做個血凝。如果發生血凝，并且呈現一定的梯度關系，那簡直就