1、分子生物學(xué)論文2000 分子生物學(xué)論文參考文獻(xiàn)分子生物學(xué)論文2000，分子生物學(xué)論文是生物工程中非常具有挑戰(zhàn)性的一個(gè)課題，下面我們?yōu)榇蠹規(guī)?lái)一篇已經(jīng)經(jīng)過老師指導(dǎo)并修改的分子生物學(xué)論文。分子生物學(xué)論文2000摘要：PCR是分子生物學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)，又是常規(guī)技術(shù)。它的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的開展，旋即被迅速推廣并應(yīng)用到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。關(guān)鍵詞：PCR、開展簡(jiǎn)史、根本原理、根本操作、主要應(yīng)用PCR技術(shù)一、概念：聚合酶鏈?zhǔn)椒错憄olymerase chain reaction,PCR是體外擴(kuò)增DNA序列的技術(shù)。它與分子克隆和DNA序列分析方法幾乎構(gòu)成了整個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的根底。在這三種技術(shù)中，P

2、CR方法理論上出現(xiàn)最早，理論中應(yīng)用也最廣泛。PCR技術(shù)使對(duì)微量的核酸DNA或RNA操作變得簡(jiǎn)單易行，同時(shí)還可以使核酸研究脫離活體生物。PCR技術(shù)的創(chuàng)造是分子生物學(xué)的一項(xiàng)革命，它極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)以及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的開展。二、根本原理1PCR技術(shù)的根本原理：PCR反響的根本成分包括：模板DNA(待擴(kuò)增DNA)、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)根本反響步驟構(gòu)成：模板DNA的高溫變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DN

3、A解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反響作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的低溫退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的適溫延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反響原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保存復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保存復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保存復(fù)制鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。2PCR的反響動(dòng)力學(xué)：PCR的三個(gè)反響步驟反復(fù)進(jìn)展，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上

4、升。反響最終的DNA擴(kuò)增量可用Y(1X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反響中平均效率達(dá)不到理論值。反響初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩亍４蠖鄶?shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)是不可防止的。3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩局部。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5'端之間，是需要擴(kuò)增

5、的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反響周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的，3'端那么沒有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段。不難看出“短產(chǎn)物片段是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段那么以算術(shù)倍數(shù)增加

6、，幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR的反響產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。四標(biāo)準(zhǔn)的PCR反響體系：10×擴(kuò)增緩沖液10ul 4種dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ug TaqDNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至100ulPCR反響五要素：參加PCR反響的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。引物：引物是PCR特異性反響的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體

7、外大量擴(kuò)增。酶及其濃度：目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反響約需酶量2。5U(指總反響體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低那么合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有親密關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本。Mg2+濃度：Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反響中，各種d

8、NTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。三、PCR技術(shù)開展簡(jiǎn)史人類對(duì)于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。20世紀(jì)60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外別離技術(shù)。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。但是，當(dāng)時(shí)的基因序列分析方法尚未成熟，對(duì)熱具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動(dòng)合成階段，這種想法似乎沒有任何實(shí)際意義。1985年，美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過兩年的努力，創(chuàng)造了PCR技術(shù)，并在Science雜志上發(fā)

9、表了關(guān)于PCR技術(shù)的第一篇學(xué)術(shù)論文。從此，PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。但是，最初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟，在當(dāng)時(shí)是一種操作復(fù)雜、本錢高昂、“中看不中用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。1988年初，Keohanog通過對(duì)所使用的酶的改進(jìn)，進(jìn)步了擴(kuò)增的真實(shí)性。此后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大進(jìn)步。也正是由于此酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術(shù)得到了廣泛地應(yīng)用，使該技術(shù)成為遺傳與分子生物學(xué)分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進(jìn)：它從一種定性的分析方法開展到定量測(cè)定；從

10、原先只能擴(kuò)增幾個(gè)kb的基因到目前已能擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。四、PCR技術(shù)的操作一PCR的根本成分PCR包括7種根本成分：模板DNA、特異性引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸dNTP、二價(jià)陽(yáng)離子、緩沖液及一價(jià)陽(yáng)離子。模板DNA：包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、預(yù)先擴(kuò)增的DNA、cDNA和mRNA分子等幾乎所有形式的DNA和RNA都能成為PCR技術(shù)反響的模板。除此之外，PCR反響還可以直接以細(xì)胞為模板。特異性引物：是一段與模板DNA鏈結(jié)合的寡核

11、苷酸片段，對(duì)于DNA的擴(kuò)增起到引發(fā)的作用。熱穩(wěn)定DNA聚合酶：這是PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的關(guān)鍵。熱穩(wěn)定DNA聚合酶是從兩類微生物中別離的：一類是嗜熱和高度嗜熱的真細(xì)菌，另一類是嗜熱古細(xì)菌。如今又出現(xiàn)了一種兼顧了幾種DNA聚合酶特點(diǎn)的混合型酶。脫氧核苷三磷酸dNTP：是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。二價(jià)陽(yáng)離子：常用到Zn2+和Mg2+,作為構(gòu)成熱穩(wěn)定性DNA聚合酶的成分之一。緩沖液：一般使用Tris-Cl緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)的為10mmol/L,并將其調(diào)節(jié)到8.38.8之間。一價(jià)陽(yáng)離子：一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善擴(kuò)增的產(chǎn)物質(zhì)量。二PCR的根本操作PCR

12、是一種級(jí)聯(lián)反復(fù)循環(huán)的DNA合成反響過程。PCR技術(shù)的根本反響由三個(gè)步驟組成：1.變性：通過加熱使模板DNA完全變性成為單鏈，同時(shí)引物自身和引物之間存在的局部雙鏈也得以消除；2.退火：將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA退火結(jié)合；3.延伸：將溫度升高，熱穩(wěn)定DNA聚合酶以dNTP為底物催化合成DNA鏈延伸。以上三部為一個(gè)循環(huán)，新合成的DNA分子又可以作為下一輪合成的模板，經(jīng)屢次循環(huán)后即可到達(dá)擴(kuò)增DNA片段的目的。三PCR操作中的注意和要求1、污染的預(yù)防進(jìn)展PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。1劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做

13、到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無(wú)論是否可以到達(dá)單人單管，均要?jiǎng)?wù)實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)展，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)展：標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備；PCR擴(kuò)增區(qū)，包括反響液的配制和PCR擴(kuò)增；產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備PCR擴(kuò)增?產(chǎn)物分析?產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。2、環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，假設(shè)不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，假設(shè)預(yù)防措施比較嚴(yán)密，那么考慮可能為環(huán)境污染。環(huán)境污染中常見的污染源主要有：1模板提取時(shí)真空抽干裝

14、置；2凝膠電泳加樣器；3電泳裝置；4紫外分析儀；5切膠用刀或手術(shù)刀片；6離心機(jī)；7冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒?yàn)臺(tái)面等；此時(shí)可用擦拭實(shí)驗(yàn)來(lái)查找可疑污染源。用無(wú)菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；20.1ml去離子水浸泡；3取5ml做PCR實(shí)驗(yàn)；4電泳檢測(cè)結(jié)果。8氣溶膠。假設(shè)經(jīng)過上述追蹤實(shí)驗(yàn)，仍不能查找到確切污染源，那么污染可能是由空氣中PCR產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時(shí)就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，假設(shè)條件不允許，那么重新設(shè)計(jì)新的引物與原引物無(wú)相關(guān)性。三污染處理1、環(huán)境污染1稀酸處理法：對(duì)可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡使剩余DNA脫嘌呤；2紫外照射UV法：紫外波長(zhǎng)nm一般選擇254/300nm，照射

15、30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對(duì)500bp以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大。UV照射時(shí)，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會(huì)形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長(zhǎng)，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列。在受照射的長(zhǎng)DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)

16、量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。假設(shè)這些位點(diǎn)0.13/堿基在DNA分子上隨機(jī)分布，一個(gè)500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點(diǎn)，那么，105個(gè)這樣的分子中每個(gè)分子中會(huì)至少有一處損傷。相反，假設(shè)100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個(gè)拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長(zhǎng)度限制的原因。2反響液污染可采用以下方法之一處理：1DNase I法：PCR混合液未加模板和Taq聚合酶參加0.5U DNase I，室溫反響30min后加熱滅活，然后參加模板和Taq聚合酶進(jìn)展正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA的序列；2內(nèi)切酶法：選擇識(shí)別4個(gè)堿基的內(nèi)切酶如Msp I

17、和Taq I等，可同時(shí)選擇幾種，以抑制用一種酶只能識(shí)別特定序列的缺陷，室溫作用1h后加熱滅活進(jìn)展PCR；3紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)展紫外照射，本卷須知與方法同上述UV照射法；4g射線輻射法：五、PCR的主要應(yīng)用最初建立PCR是為了擴(kuò)增序列的靶基因。因?yàn)樵赑CR方法問世以前，要獲得一個(gè)靶基因，必須建立基因文件庫(kù)，然后從成千上萬(wàn)的菌落中通過Southern blot雜交挑選含有靶基因的克隆。這樣既費(fèi)時(shí)又費(fèi)錢，特別是在克隆真核生物基因時(shí)難度更大。自從建立了PCR方法以后，使克隆序列的基因變得非常容易。為了適應(yīng)分子生物學(xué)的快速開展，PCR方法也得到了不斷開展，如今PCR已應(yīng)用

18、到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。一根底研究方面的應(yīng)用目前從事分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說幾乎沒有一個(gè)分子生物學(xué)家沒有使用過PCR。因此，PCR與分子克隆一樣是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，可用于到達(dá)以下目的：擴(kuò)增目的基因和鑒定重組子；克隆基因；基因功能和表達(dá)調(diào)控的研究；基因組測(cè)序；制備單鏈模板；致突變；二PCR在臨床上的應(yīng)用1、在遺傳學(xué)上的應(yīng)用：人類的遺傳性疾病是因?yàn)槟骋粔A基序列發(fā)生了突變，使之缺失或形成某一限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，通過PCR結(jié)合限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析PCR-RFLP，就可以從基因的程度對(duì)遺傳性疾病進(jìn)展分析。例如，血友病甲是一種常見的遺傳性出血性疾病，患者體

19、內(nèi)缺乏凝血因子FVIII這是由于基因第14個(gè)外顯子的第336位氨基酸的編碼基因發(fā)生了突變，產(chǎn)生了一個(gè)新的PstI酶切點(diǎn)，因此可以使用PCR-RFLP對(duì)血友病進(jìn)展診斷。PCR還可以用來(lái)檢測(cè)遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病。2、在腫瘤研究中的應(yīng)用：PCR已日益廣泛應(yīng)用于腫瘤的病因與發(fā)病機(jī)理研究以及腫瘤診斷與治療的研究中。例如，差異顯示PCR技術(shù)能針對(duì)不同腫瘤尋找其特異而敏感的標(biāo)志物，并用于腫瘤早期診斷、判斷預(yù)后及療效評(píng)估。另一方面，在使用普通放療、化療的同時(shí)可結(jié)合定量PCR技術(shù)檢測(cè)微小殘留病灶，以進(jìn)一步改進(jìn)治療方案。此外，由于癌癥的發(fā)生在一定意義上是單個(gè)細(xì)胞分子發(fā)生變化，因此可以使用單細(xì)胞PC

20、R技術(shù)對(duì)癌癥的發(fā)病機(jī)理進(jìn)展研究。檢測(cè)病原體3、在基因分型中的應(yīng)用：當(dāng)進(jìn)展器官移植時(shí)并須先組織配型工作，此時(shí)常應(yīng)用序列特異性寡核苷酸多態(tài)性PCRPCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP對(duì)人類白細(xì)胞抗原h(huán)uman leukocyte antigen,HLA進(jìn)展分型，使移植成功率大大進(jìn)步。此外PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性也可以用于對(duì)HLA的分型。三在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用例如：最早應(yīng)用DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性結(jié)合PCR-RFLP來(lái)進(jìn)展法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。目前發(fā)如今真核生物基因組編碼和非編碼序列中的短串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間存在著差異，因此可以使用