1、纖維素酶活力的測定纖維素酶活力的測定1. 目的和內(nèi)容目的和內(nèi)容 目的：目的：了解纖維素酶的種類和測定原理，掌握了解纖維素酶的種類和測定原理，掌握 其活力的測定方法。其活力的測定方法。 內(nèi)容：內(nèi)容：測定并計算纖維素酶的活力。測定并計算纖維素酶的活力。2. 基本原理基本原理 2.1. 纖維素酶是一類分解纖維素的纖維素酶是一類分解纖維素的復(fù)合酶復(fù)合酶，目前公認(rèn)的有，目前公認(rèn)的有四種四種:（1）內(nèi)切）內(nèi)切-1,4-葡聚糖酶；（葡聚糖酶；（2）外切）外切-1,4-葡聚糖酶；葡聚糖酶；（3）纖維二糖水解酶；）纖維二糖水解酶；（4）纖維二糖酶（）纖維二糖酶（-葡聚糖苷酶）。葡聚糖苷酶）。纖維素酶液中各種酶的

2、作用方式圖纖維素酶液中各種酶的作用方式圖 2.2 纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生的纖維二糖、葡萄糖等還原纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生的纖維二糖、葡萄糖等還原糖能將堿性條件下的糖能將堿性條件下的3,5-二硝基水楊酸（二硝基水楊酸（DNS）還原，生成還原，生成紅棕色的氨基化合物，在紅棕色的氨基化合物，在540nm波長處有最大光吸收，在一波長處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系，利定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系，利用比色法測定其還原糖生成的量就可測定纖維素酶的活力。用比色法測定其還原糖生成的量就可測定纖維素酶的活力。 由不同底物測得的酶活力分別稱作由不同底物測得的酶活

3、力分別稱作FPA (濾紙?zhí)敲富盍V紙?zhí)敲富盍? 和和CMCA (羧甲基纖維素酶活力羧甲基纖維素酶活力)。DNSDNS與還原糖的反應(yīng)與還原糖的反應(yīng)540nm濾紙葡萄糖氨基化合物(紅棕色)纖維素酶測定吸光值DNS試劑50,1h沸水浴10min 為了統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，目前通常用中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)為了統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，目前通常用中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn)QB 2 5 8 3 一一2 0 0 3，以濾紙作為纖維素酶作用的底物。，以濾紙作為纖維素酶作用的底物。 纖維素酶水解纖維素酶水解濾紙濾紙釋放的釋放的還原糖還原糖，與堿性條件下的，與堿性條件下的DNS試試劑發(fā)生反應(yīng)，生成紅棕色的氨基化合物，該化合物在劑發(fā)生反

4、應(yīng)，生成紅棕色的氨基化合物，該化合物在540nm下下有最大光吸收，由此，可根據(jù)測得的吸光值與葡萄糖濃度的關(guān)有最大光吸收，由此，可根據(jù)測得的吸光值與葡萄糖濃度的關(guān)系來計算纖維素酶的活力（系來計算纖維素酶的活力（FPA）。）。2.3 濾紙酶活力濾紙酶活力 Filter paper activity(FPA) v l g 固體酶( 或1mL 液體酶) ，在( ( 50 ,指定pH條件下( 酸性 纖維素酶pH4.8，中性纖維素酶p H 6 . 0 ) , l h 水解濾紙底物，產(chǎn)生出相當(dāng)于l m g葡萄糖的還原糖量，為1 個酶活力單位，以u / g ( 或 u / m L )表示。3.1器材：器材：水

5、浴鍋、水浴鍋、分光光度計、分光光度計、記時器、記時器、 比色管（比色管（4支支+6支）、支）、移液管（移液管（5支）、支）、吸耳球吸耳球3.2試劑（公用）：試劑（公用）： 如下如下 3.器材和試劑器材和試劑1 ） D N S試劑試劑 稱取3 , 5 一 二硝基水楊酸( 1 0 10 . 1 ) g，置于約6 0 0 m L水中，逐漸加入氫氧化鈉l o g ，在5 0 水浴中( 磁力)攪拌溶解，再依次加入酒石酸甲鈉2 0 0 g 、苯酚( 重蒸) 2 g 和無水亞硫酸鈉5 g ，待全部溶解并澄清后，冷卻至室溫，用水定容至 I O O O m L ，過濾。貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置7 d 后使

6、用。2） 檸檬酸緩沖液，檸檬酸緩沖液，0.05 mol/LpH4.8( 適用于酸性纖維素酶適用于酸性纖維素酶) 稱取一水檸檬酸4.83 g ,溶于約750 mL水中，在攪拌情況下，加入檸檬酸三鈉7.94g ,用水定容至1000 mL 。調(diào)節(jié)溶液的pH到( 4.8 士0.05 ) 備用。 注:也可 采用pH 4.8乙 酸緩沖溶液: 稱取三水乙酸鈉8 . 1 6 g , 溶于約7 5 0 m l , 水中 ， 加入乙 酸2 . 3 1 m l , ， 用水定容至1 0 0 0 M L .調(diào)節(jié)溶液的p H到( 4 . 8 1 0 . 0 5 ) 備用3) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液( 1

7、O m g / m L) 稱取于( 1 0 3 士2 ) 下烘千至恒重的無水葡萄糖1 g ,精確至0.1 m g ，用水溶解并定容至1 0 0 m L ,4) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液 分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0 . 0 0 , 1 . 0 0 , 1 . 5 0 , 2 . 0 0 , 2 . 5 0 , 3 . 0 0 , 3 . 5 0 m L于1 0 ML容量瓶中，用水定容至 1 0 m L ，蓋塞，搖勻備用。 上述系列濃度應(yīng)根據(jù)需要自行調(diào)整。5) 快速定性濾紙快速定性濾紙 ( 杭州新華一號濾紙) 滬1 5 c m( 每批濾紙，使用前用標(biāo)準(zhǔn)酶加以校正) 。 4.1 繪制標(biāo)

8、準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 按表A. l 規(guī)定的量，分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液 、緩沖溶液 和D NS試劑于各管中( 每管號平行作3個樣) ，混勻。 將標(biāo)準(zhǔn)管同時置于沸水浴中，反應(yīng) 1 0 mi n 。取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至2 5 mL .蓋塞，混勻。用1 0 mm比色杯，在分光光度計波長5 4 0 n n 處測量吸光度。以葡萄糖量為橫坐標(biāo)， 以吸光度為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 獲得線性回歸方程。 線性回歸系數(shù)應(yīng)在0 . 9 9 9 0以上時方可使用( 否則須重做) 。 4 . 2 樣樣 品的測定品的測定4 . 2 . 1 待測酶液的制備 稱取酶樣1 g , 精確至0 . 1 m g ( 或

9、吸取液體酶樣1 mL ， 精確至0 . 0 1 m L ) ， 用水（檸檬酸緩沖液，0.05 mol/LpH4.8）溶解100ml(100倍），之后分別做200倍、400倍、600倍、800倍稀釋， 磁力攪拌混勻， 準(zhǔn)確稀釋定容 放置1 0 m i n ， 待測。4 . 2 . 2 濾紙條的準(zhǔn)備 將待用濾紙放入 ( 硅膠)干燥器中平衡2 4 h : 將水分平衡后的濾紙制成寬I c m、質(zhì)量為( 5 。 士。 . 5 ) m g的濾紙條，折成M型 備用。4.3 操作程序操作程序FPA酶活力按式 ( A. l )計算。XA l / 0 . 5 n 式中式中: X 樣品的濾紙酶活力( ( F P A)